首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 基础医学论文 > 实验医学论文 > PTK6染色中消除内源性过氧化物酶的研究

PTK6染色中消除内源性过氧化物酶的研究

2025-06-25 79 上传者：管理员

摘要：目的探究PTK6染色中消除内源性过氧化物酶在鼠胰腺癌组织免疫组织化学染色结果的效果。方法对29例鼠胰腺癌组织的冰冻切片进行分组，实验组：用3%H2O2甲醇溶液，对照组：用3%H2O2 PBS缓冲液消除组织间内源性过氧化物酶，检测免疫组化染色结果中PTK6抗体的表达效果。结果通过实验应用3%H2O2甲醇溶液作为消除内源性过氧化物酶的免疫组化染液，实验组与对照组间敏感度对比差异无统计学意义（P > 0.05）；免疫组化染色特异性对比差异具有统计学意义（96.56%vs. 17.24%，χ2=36.65,P<0.05）；免疫组化染色结果显示，实验组几乎没有脱片现象，细胞形态相对完整，细胞结构定位清楚可见，背景清晰。结论不同的阻断剂有不同的特性，应结合组织结构特点、抗原特异性，选择适合的阻断剂以获得特异性及细胞形态较好的免疫组化染色结果。

关键词：
免疫组织化学
胰腺癌
蛋白质检测技术
过氧化物酶
酪氨酸蛋白激酶6
加入收藏

免疫组化染色已经成为现代病理诊断中广泛被使用的蛋白质检测技术｡该技术原理是基于特异性抗体与组织中的特异性抗原结合,在判断肿瘤组织的来源､病理分类及良性､恶性肿瘤的鉴定诊断等方面起着重要作用[1-2]｡虽然技术十分成熟,但免疫组化染色问题却长期存在｡在免疫组化染色实验中经常会遇到组织内源性过氧化物酶表达过高,不能被完全灭活,导致非特异性染色出现,影响结果的观察和判读[3]｡蛋白酪氨酸激酶6(proteintyrosinekinase6,PTK6),位于人染色体20q13.3,由氨基末端结构域､Src同源SH3结构域､SH2结构域和羧基末端酪氨酸激酶催化结构域组成,已知其在正常分化的细胞和环境依赖性过程中发挥作用｡许多实验表明,PTK6在许多肿瘤中高度表达,包括乳腺癌､肺癌､卵巢癌等,在肿瘤发生､发展中起着重要的作用,使其作为肿瘤治疗的新靶标引起广泛关注[4]｡目前利用PTK6免疫组化染色是验证自噬相关外泌体基因在胰腺癌病理组织中的表达情况,挖掘对胰腺癌具有诊断及预后价值相关基因的一项重要意义｡在进行鼠胰腺癌组织PTK6免疫组化染色,由于采用3%H2O2-磷酸盐缓冲液(PBS)阻断剂消除组织内源性过氧化物酶,出现染色结果不理想,背景出现不同程度非特异性染色､局部脱片､细胞核定位边界不清楚等现象｡针对这一情况,本研究采用3%H2O2甲醇溶液消除组织内源性过氧化物酶,获得了染色背景清晰,色泽鲜艳,无非特异性染色,细胞核定位边界清楚,效果优良｡

1、资料与方法

1.1基本资料鼠胰腺癌组织标本29例;AntiPTK6一抗购于Proteintech公司;二抗及显色剂分别购于沈阳联星;抗原修复液柠檬酸缓冲液(pH6.0)､磷酸盐缓冲液(pH7.2,PBS)､30%过氧化氢､甲醇购于北京中杉｡高压灭菌仪器(日本Yamato公司),电热恒温干燥箱(日本Yamato公司),生物显微镜(Leica),冰冻切片机(LeicaCM1950)｡

1.2实验方法

1.2.1制作鼠胰腺癌组织切片选取8~9周龄C57BL/6NMU基因全身敲除小鼠(本研究已经本院伦理委员会批准通过,伦理批号为KT2022424),采用腹腔麻醉,剔除左侧腹部皮毛,碘伏消毒､剪开腹部手术部位,暴露胰腺组织,缓慢将混均于Matrigel基质胶中培养生长对数期细胞,2×107/ml的Panc02悬液注入胰尾组织内,基质胶凝固拔出针头,手术缝合完成肿瘤种植｡荷瘤3周后,采用颈椎脱位法处死小鼠,获取鼠胰腺癌组织｡制作冰冻切片厚度5μm,每例组织切片2张,载玻片平贴组织,室温干燥,浸入4℃冷丙酮固定10min,进行组化染色｡

1.2.2染色流程组织切片先采用PBS缓冲液洗3次,每次5min｡然后对鼠胰腺癌切片进行分组,实验组切片滴加50μl/片3%H2O2甲醇溶液､对照组切片滴加50μl/片3%H2O2PBS溶液,室温孵育,10min｡以下染色同步进行:PBS洗3次,5min/次｡将组织切片置于染色架上,放入装有抗原修复液(pH6.0)容器中,置于高压灭菌锅内,加压,121℃修复时间控制在150s左右,高压进行抗原修复[5]｡待高压锅压力为零时,取出组织切片,静置至室温｡PBS洗3次,5min/次｡然后滴加山羊血清液50μl/片进行非特异性抗原封闭,目的降低非特性染色,室温孵育30min｡用滤纸吸除多余液体｡切片滴加Anti-PTK6抗体1∶100,50μl/片,37℃孵育2h,PBS洗3次,5min/次｡切片滴加辣根过氧化物酶酶标IgG聚合物,50μl/片,37℃孵育30min｡PBS洗3次,5min/次｡配置二氨基联苯胺显色液(DAB)(应避光保存,60min内有效)｡滴加50μl/片显色液,室温显微镜下观察,显色时间5~15min｡自来水冲洗｡复染､封片､镜检｡

1.2.3组化染色结果显微镜下观察和统计,实验组和对照组,两种不同阻断剂免疫组化染色效果:脱片情况､细胞形态相对完整性及特异性染色细胞核定位清楚及背景清晰情况等综合良好率｡

1.2.4统计学方法采用SPSS22.0软件和GraphpadPrism软件分析处理数据,计数资料以[n(%)]表示,采用χ2检验｡P<0.05表示差异有统计学意义｡

2、结果

2.1免疫组化染色组织结构比较实验组与对照组均采用3%H2O2甲醇溶液阻断剂进行免疫组化染色,结果表明实验组与对照组间组织清晰度､结构完整程度及敏感度综合评估比较结果,其差异无统计学意义(P>0.05)｡

2.2不同阻断剂染色结果比较实验组切片(29例)滴加3%H2O2甲醇溶液,对照组切片(29例)滴加H2O2PBS溶液,结果表明:实验组切片中28例核质结构清晰(占96.56%),1例欠佳(占3.44%,局部脱片);对照组切片中5例核质结构清晰(占17.24%),23例背景不清晰(占79.32%),1例欠佳(占3.44%,脱片)｡实验组细胞形态完整,背景清晰,两组间染色特异性比较差异具有统计学意义(96.56%vs.17.24%,χ2=36.65,P<0.05)｡结果见图1｡

图1 分别应用两种阻断剂进行鼠胰腺癌组织切片免疫组化结果特异性比较(×400)

3、讨论

在免疫组化染色过程中采用3%H2O2PBS缓冲液阻断剂消除组织内源性过氧化物酶,可以获得细胞形态正常,细胞核定位边界清楚,背景清晰,切片完整度良好｡内源性过氧化物酶的存在会影响染色的特异性,因为正常组织中也含有过氧化物酶,它会催化底物显色,导致假阳性结果｡免疫组化是一种基于组织的诊断和生物标志物检测的成熟技术,在各种疾病中发挥预测､诊断､预后和治疗监测的作用[6]｡发展至今,染色技术十分成熟,但染色问题却长期存在,其主要原因是影响染色的因素颇多｡免疫组化染色步骤繁多,不同的组织前处理程序､不同的实验室环境､不同的抗原修复方法及配套的检测系统等均可影响最终的染色结果[7-8]｡其中影响较大的是组织的前处理､固定､制作切片､抗原修复条件､消除组织内过氧化物酶､一抗及检测系统的敏感度和特异性､孵育时间和温度､复染等[9],每个实验步骤都很重要｡PTK6免疫组化染色,消除组织内过氧化物酶时,观察到对照组组织切片上出现分散的小气泡,预示组织内源性过氧化物酶比较多,过氧化氢溶液可能会与血细胞中的过氧化物酶产生强烈的反应,产生气泡,破坏组织结构和细胞形态,显色后结果,背景出现不同程度的非特异性染色､细胞结构不清､细胞核定位边界不清楚等现象,干扰结果的判断｡而实验组组织切片上没有出现小气泡,这表明阻断剂已完全阻断组织内源性过氧化物酶,最终获得优良的免疫组化染色效果｡免疫组化技术是病理诊断和精准治疗的重要检测手段[10]｡每张优质组织切片的免疫组化染色需要真阳性染色结果表达,在预期对应的组织细胞中,应定位清晰准确,间质清楚.无或少背景着色[11]｡在PTK6组化染色实验中,因鼠胰腺癌因组织内源性过氧化物酶过高,3%H2O2PBS缓冲液阻断剂不能完全消除内源性过氧化物酶,导致辣根过氧化物酶标记出现非特异性染色｡组织中内源性过氧化物酶和抗体封闭对于减小背景染色和降低假阳性染色十分重要｡内源性过氧化物酶通常存在于组织的红细胞､坏死区域和急性炎症组织中的中性粒细胞,通常不会对染色结果判断造成干扰,但是当组织中的内源性过氧化物酶过于丰富时会干扰染色结果的判断[12]｡实验组选择3%H2O2甲醇溶液消除组织内过氧化物酶得到了满意的染色结果｡甲醇溶液的使用方法也很重要,先用PBS或水湿润切片后,再滴加阻断剂,可以防止甲醇溶液扩散到切片的四周,而是聚集在组织块处｡从而联想到含有丰富血细胞的标本中,如骨髓､胎盘､脾等组化染色时,可以使用3%H2O2甲醇溶液孵育20min来灭活内源性过氧化物酶,预计可以获得满意的染色结果｡

综上所述,胰腺癌属于高度侵袭性的消化系统恶性肿瘤,其发生､发展､转移受到多种基因调控,致病机制仍未完全阐明,早期临床诊断十分困难[13]｡针对鼠胰腺癌组织PTK6检测免疫组化染色,推荐采用3%H2O2甲醇溶液阻断剂消除内源性过氧化酶,以获得理想的免疫组化染色结果,可为临床胰腺癌的早期诊断和指导临床治疗提供参考和借鉴｡

参考文献:

[1]陈雅丽,王凤翔,邹琼瑜,等.衣康酸酐抗原修复液在改善前处理不佳组织的免疫组织化学染色结果中的应用研究[J].中国现代医生,2023,61(16):67-70,75.

[2]王伯法,李玉松.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:354.

[3]杨清海,傅椿辉.灭活组织内丰富内源性过氧化物酶的方法和体会[J].诊断病理学杂志,2013,20(3):191.

[4]赵川,王秀月,陈彻,等.酪氨酸蛋白激酶6在肿瘤发生与发展中的研究进展[J].肿瘤,2017,37(3):302-305.

[5]潘勇权,区可谊,林小龙,等.肿瘤病理鉴别中特殊染色技术联合免疫组化技术的价值分析[J].系统医学,2023,8(14):73-76.

[6]朵建英,朱文佳,文欣玫,等.两种皮肤小神经纤维PGP9.5染色方法的比较[J].诊断病理学杂志,2024,31(4):349-350.

[7]吴昊,程阳,曾智,等.正常组织在免疫组织化学染色对照设置中的应用[J].诊断病理学杂志,2024,31(3):256-257.

[8]李梅,龙卫国,钟安菁,等.不同抗原修复条件对肠癌MMR蛋白免疫组织化学染色效果的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2021,30(2):185-188.

[9]吴兴旗,党啟华,徐晶晶,等.全自动免疫组化染色仪比较不同抗原修复液对P53的染色结果[J].临床与实验病理学杂志,2024,40(6):663-664.

[10]陈贵东,杨通,沈艳,等.抗原修复时间对不同克隆号P40免疫组化染色结果的影响[J].广州医科大学学报,2024,52(2):51-55.

[11]张铭,司少艳,韩瑞刚,等.免疫组化SP法与PicTureTM两步法的比较[J].诊断病理学杂志,2004,11(1):58-59.