随着肿瘤及各类慢性病年轻化趋势，使女性在育龄期更易发生卵巢早衰、绝经和围绝经期提前、卵巢内分泌功能紊乱和不孕等情况［1］。此外，由于年龄相关的生育力下降以及社会、环境污染等原因导致的女性卵巢功能损伤，也会加剧生育力保存的迫切需求。早发性卵巢功能不全( premature ovarian insufficiency，POI)是指女性在40岁之前出现卵巢功能下降，并且以月经及性激素变化为主要特征的内分泌疾病。若不及时治疗，会导致骨质疏松、心血管疾病、老年性痴呆等疾病的提前发生，严重会影响患者的身心健康［2］。目前本病的治疗主要采用激素补充疗法或诱导排卵等［3］西医治疗，但不仅服药时间长、停药后易复发，且存在无法重建患者卵巢功能等局限性。因此，寻找更安全有效的替代疗法已成为该研究领域的热点问题。“哈氏育阴汤”为天津哈氏妇科流派治疗卵巢功能减退经验方，前期临床研究显示，在改善临床症状方面疗效显著。因此，本研究拟通过构建去氧乙烯基环己烯( 4－Vinylcyclohexene Diepoxide，VCD)诱导的大鼠卵巢功能损伤模型，观察不同时机“哈氏育阴汤”干预对POI大鼠卵巢功能的影响，探讨其可能的差异化保护机制。

1、材料与方法

1. 1材料

1. 1. 1动物SPF级

8周龄雌性SD大鼠60只，体质量在( 220±20) g之间，均购自北京华阜康生物科技股 份 有 限 公 司(许 可 证 号: SCXK (京) 2019－0008)。在适应性喂养5天后，每日行阴道脱落细胞学涂片并显微镜观察连续10天，选取56只动情周期规律的SD雌性大鼠进入实验。本实验通过易生源基本科技(天津)有限公司实验动物伦理委员会审查，伦理审查批件批号YSY－DWLL－2022322。

1. 1. 2药物及配制

VCD(厂家:上海麦克林生化科技有限公司，货号: V820469－100mL)，芝麻香油(厂家:河北红猴王食用油调料有限公司，货 号:SC10213092200209)，大鼠每日腹腔注射剂量参照Muhammad等报道方法［4、5］VCD160mg /kg，即每次注射VCD溶液5mL /kg( VCD溶液配置比例为0. 15mLVCD与4. 85mL芝麻油混合)。哈氏育阴汤:北沙参20 g，醋龟板14 g先煎、女贞子14 g，当归10 g，熟地黄20 g，酒萸肉14 g，桑葚20 g，菟丝子20 g，枸杞子14 g，酒苁蓉10 g，玉竹14 g，白芍10 g，香附10 g，购自天津中医药大学第一附属医院药房。根据“人和动物间按体表面积折算的等效计量比率表”，配成低浓度(含 生 药 量0. 9 g /mL )和 高 浓 度(含 生 药 量3. 6 g /mL)，相当于临床等效剂量的1 /2倍、2倍，配制好的中药液于4℃ 冰箱内储存备用。结合雌激素片(厂 家:新疆新姿源生 物制药有限公司，规 格:625μg，批准文号:国药准字H20090172)用蒸馏水溶解药片，配成含结合雌激素0. 0075mg /mL的药液，4℃冰箱储存备用。

1. 1. 3主要试剂

促卵泡生成素( FSH)测定试剂盒(厂家:北京美联泰科生 物技术有限公司，批 号230811)、黄体生成素( LH)测定试剂盒(厂家:北京美联泰科生物技术有限公司，批 号230811 )、雌 二 醇( E2)测定试剂盒(厂家:北京美联泰科生物技术有限公司，批号230811)、BCL－2 antibody(厂家:武汉三鹰，货号26593－1－AP，批号00118140)，BAX antibody (厂 家:武 汉 博 士 德，货 号BM3964，批 号BST1759364)。

1. 1. 4主要仪器

全自动化学发光免疫分析仪(厂家:北京美 联 泰 科 生 物 技 术 有 限 公 司，型 号MS－Fast)、全 景 扫 描 仪(厂 家: 3DHISTECH，型 号3DHISTECH P250 FLASH)、正置光学显微镜(厂家:OLYMPUS，型号OLYMPUS CKX43－LP)等。

1. 2方法

1. 2. 1模型制备及分组

56只大鼠随机选取48只每日腹腔注射VCD160mg /kg，复制POI大鼠病理模型;其余8只作为空白组腹腔注射等量生理盐水，均注射15天。造模结束24h后，每只大鼠每日均在同一时间(上午8: 00)进行阴道脱落细胞学检查，连续10天用显微镜观察大鼠阴道脱落细胞形态、种类及分布，并记录动情周期的变化。动情周期紊乱则判定造模成功。

1. 2. 2给药

用随机数字表法将造模成功的48只大鼠分为模型组、西药组、中药预防组(设高、低剂量组)，中药干预组(设高、低剂量组)，每组8只。空白组和模型组同等剂量的生理盐水灌胃，每日1次，共4周;西药组以结合雌激素0. 075mg /kg灌胃，每日1次，共4周;中药预防组以哈氏育阴汤高剂量( 36 g /kg)、低剂量( 9 g /kg)灌胃，在造模中1周(第9天至第15天)及造模结束后4周，每日1次，共干预5周。中药干预组以哈氏育阴汤高剂量( 36 g /kg)、低剂量( 9 g /kg)灌胃，造模结束后开始干预，每日1次，共4周。

1. 2. 3取材

实验结束当日，所有大鼠禁食水。次日早8: 00开始麻醉、取材。各组大鼠腹主动脉取血4～5 mL保存至采血管中。采血完成后，迅速摘取双侧卵巢、子宫，剥离周围的筋膜及脂肪，称取湿重并记录。将每只大鼠左侧卵巢，存放于4%多聚甲醛固定液中，右侧卵巢放置液氮中快速冷冻后再转移至 －80℃超低温冰箱保存。

1. 3指标检测及方法

1. 3. 1卵巢子宫指数

计算方法:卵巢指数=卵巢总湿重( mg) /体重( g)×100% ;子宫指数=子宫总湿重( mg) /体重( g)×100%。

1. 3. 2血清性激素水平检测

采用全自动化学发光免疫分析仪检测大鼠血清FSH、LH、E2水平。

1. 3. 3卵巢形态学观察

将卵巢组织进行石蜡包埋，行组织切片和HE染色，显微镜下观察卵巢组织变化。并根据卵泡结构及大小对卵泡分级，分级标准依据参考文献［6］:原始卵泡( p rimordial follicles) ;初级生长卵泡( p rimary follicles) ;次级生长卵泡( secondary follicles) ;成熟卵泡( mature follicles) ;闭锁卵泡( atretic follicles)。

1. 3. 4免疫组织化学染色

采用免疫组织化学技术( IHC)检测卵巢组织中细胞凋亡相关蛋白Bcl－2、Bax的阳性表达情况。

1. 4统计学方法

运用SPSS21. 0统计软件进行数据分析。计量资料满足正态分布时，采用单因素方差分析，两两比较时，若方差齐采用LSD法;若方差不齐采用Dunnett＇sT3法分析，结果以均数 ± 标准差( x±s)表示。若P＜0. 05，则认为差异有统计学意义。

2、结果

2. 1模型评价

给予VCD腹腔注射的48只大鼠动情周期均出现不同程度的紊乱，多表现为动情间期，其中有44只大鼠在连续给药后出现无规律动情周期变化，但西药组1只，中药高剂量干预组1只，中药高、低剂量预防组各1只，共有4只大鼠仍可观察到类似规律动情周期的变化。在实验过程中模型组2只，中药高剂量预防组，中药高、低剂量干预组，西药组各有1只大鼠死亡。2. 2卵巢、子宫指数比较 与空白组相比，模型组体质量和脏器指数均下降( P＜0. 05) ;与模型组相比，西药组、中药高剂量组和中药低剂量预防组的体质量及脏器指数均上升( P＜0. 05)，而中药低剂量干预组体质量及脏器指数差异无统计学意义( P＞0. 05) ;与西药组相比，中药低剂量组脏器指数均降低( P＜0. 05)，而中药高剂量干预组体质量及脏器指数差异均无统计学意义( P＞0. 05)，中药高剂量预防组的体质量及脏器指数均上升( P＜0. 05) ;与中药低剂量组相比，中药高剂量组的体质量及脏器指数均升高( P＜0. 05)，见表1。

表1各组大鼠体重及卵巢、子宫指数比较

2. 3性激素水平比较

与空白组相比，模型组FSH和LH升高，E2降低( P＜0. 05)，这些结果表明模型组大鼠的卵巢功能下降，造模成功;与模型组比较，西药组、中药高剂量组、中药低剂量预防组FSH和LH降低，E2上升( P＜0. 05)，中药低剂量干预组FSH、LH差异均无统计学意义( P＞0. 05) ;与西药组相比，中药低剂量干预组FSH升高，E2降低( P＜0. 05)，LH无统计学意义( P＞0. 05)，中药高剂量干预组FSH、LH和E2差异均无统计学意义( P＞0. 05)，中药高剂量预防组E2上升( P＜0. 05) ;与中药低剂量组相比，中药高剂量组FSH、LH降低，E2升高( P＜0. 05)，见表2。

2. 4卵巢组织形态学比较

空白组大鼠卵巢中各级卵泡形态和数量正常，颗粒细胞排列紧密有序。模型组大鼠各级卵泡减少，闭锁卵泡增加，颗粒细胞排列疏松。与模型组相比，西药组、中药高剂量组大鼠卵巢内各级卵泡数量有所增加，卵巢萎缩的情况得到了一定程度的改善，且中药高剂量预防组更为明显，见图1。

表2各组大鼠血清FSH、LH、E2水平比较

2. 5卵巢组织中Bcl－2、Bax蛋白表达的比较

与空白组相比，模型组Bcl－2表达降低，Bax表达增加( P＜0. 05) ;与模型组相比，西药组、中药高剂量组、中药低剂量预防组Bcl－2表达增加，Bax表达降低( P＜0. 05)，而中药低剂量干预组Bcl－2和Bax表达差异无统计学意义( P＞0. 05) ;与西药组相比，中药低剂量干预组Bcl－2表达降低，Bax表达增加( P＜0. 05)，而中药高剂量干预组Bcl－2和Bax表达差异无统计学意义( P＞0. 05)，中药高剂量预防组Bcl－2表达增加( P＜0. 05) ;与中药低剂量组比较，中药高剂量组Bcl－2表达更高，Bax表达更低( P＜0. 05)，见表3、图2。

表3各组大鼠Bcl－2、Bax平均光密度值比较

图2药物干预后各组大鼠卵巢Bax蛋白表达情况

3、讨论

POI是一种常见的生殖内分泌疾病，指女性在40岁以前卵巢功能提前衰退，主要表现为月经不规律和激素水平异常变化，以及常伴有围色经期症状［7］。近年来随着环境污染的加重、社会生存压力的加大、生育年龄的推迟、带瘤生存期的延长等因素，POI发病率呈明显上升趋势［8］。POI高度异质、病因混杂，且发病隐匿，早期生化异常期并无症状，然而一旦进入临床期，卵巢功能已降低或丧失，治疗相对困难，没有恢复卵巢功能及提高卵子质量的有效方法［9］。因此，POI疾病形成前的早期预防和治疗显得尤为重要［10］。早发性卵巢功能不全，在中医学属于经水早断诸证范畴［11］，发病主要源于肾虚，同时伴有心、肝、脾等功能异常，且“血瘀”贯穿其疾病整个生理病理过程。相关中医证候分析的研究也表明，POI主要分为肝肾两虚、脾肾两虚和肾虚血瘀，其中肝肾两虚占据较大比例［12］。因此，肾虚不仅是经水早断诸证内分泌失调的病变基础，也是经水早断诸证引发诸病，及其转归的关键因素。临床研究显示［13－15］，补肾方可改善POI患者的月经情况和相关症状，调节其性激素水平，提高患者卵巢功能，还可通过调节各种细胞因子、神经递质、神经肽、激素，改善内环境而降低慢性病发生。本研究的干预药“哈氏育阴汤”是哈氏妇科流派治疗DOＲ、POI、POF等卵巢功能减退的经验方。哈氏妇科在治疗POI时［16］，重视滋阴养血调经之理念，并提出“调经养血莫如滋水养火”的治疗原则，由此，左归丸合一贯煎加减化裁而成“哈氏育阴汤”。该方在临床上具有滋补肝肾、育阴养血之良好功效。

本实验研究表明，VCD160mg /kg腹腔注射可以成功复制卵巢损伤模型，且造模时间短、成本低。文献报道中，VCD160mg /kg /d的剂量，连续腹腔注射15天造模方法是目前应用最多的一种方案［17－18］。VCD作为环境污染物，可通过加速卵泡闭锁选择性地破坏大鼠和小鼠的窦前卵泡［19］，较好地模拟自然状态下卵巢功能衰竭的进程［20］。造模中和造模结束后不同时机的中药干预，以及中药高、低不同剂量的给药方案，在大鼠卵巢子宫指数，血清性激素水平，卵巢组织形态学比较，卵巢组织凋亡相关蛋白表达方面，显示出疗效差异。如从量效关系上，中药高剂量的疗效不管是在预防组还是干预组均优于低剂量的疗效，且中药高剂量预防组中其效果更为显著;干预时机上，中药预防组疗效优于干预组，且在部分指标的测定中药高剂量预防组疗效甚至优于阳性对照组。因此，相比造模后中药干预，造模中开始中药干预其保护效应更明显。这可能是由于卵巢未损伤前中药干预能够抑制原始卵泡发育，减轻VCD特异性损伤，从而发挥保护卵巢功能的作用。此外，性激素水平的比较中，中药高剂量预防组及西药组可明显提高E2水平，降低FSH与LH水平。这说明“哈氏育阴汤”具有雌激素样作用，因此经过治疗后大鼠低雌激素水平得到改善，下丘脑 － 垂体 － 性腺轴得到调整。细胞凋亡的机制是由Bc1－2家族严密调控的，Bcl－2 /Bax的比例决定了 细 胞 在 受 到 凋 亡 信 号 刺 激 时 是 否发生凋亡［21］。西药组及中药高剂量组的Bc1－2蛋白表达上升，Bax蛋白表达下降，提示颗粒细胞凋亡的发生低于模型组，这对卵泡的发育有着积极地作用。综上，“哈氏育阴汤”可通过调控细胞凋亡相关蛋白Bcl－2、Bax的表达，对POI大鼠性腺起保护作用，并且不同时机干预，在保护POI大鼠卵巢功能方面具有效应差，且先于疾病的预防性干预优于疾病发生后的治疗。卵巢功能减退是长期渐进的过程，及时使用保护性措施阻止或延缓卵巢功能不全的进程，对保护女性生育能力具有重要意义。

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基金资助:天津市卫生健康委员会中医中西医结合科研课题(2021104); 天津哈氏妇科流派工作室(LPGZS2012-04);

文章来源:金红花.不同时机哈氏育阴汤干预对POI大鼠卵巢功能损伤的影响[J].云南中医中药杂志,2025,46(03):85-90.