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NF-κB和TNF-α炎性因子在高血糖大鼠急性心肌缺血组织的加重损伤机制

2020-09-09 204 上传者：管理员

摘要：目的：探讨NF-κB和TNF-α等炎性因子在高血糖大鼠急性心肌缺血组织的加重损伤机制。方法：选择SPF级雄性SD大鼠48只,按随机数字表法分为假手术组、高血糖合并急性心肌梗死(AMI)组(高血糖AMI组)、正常血糖AMI组,每组16只。采用分光光度法和酶联免疫吸附法检测各组大鼠心肌组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6水平,Westernblot法检测缺血心肌组织NF-κB和TNF-α表达。结果：与假手术组比较,高血糖AMI组MPO、IL-1β、IL-6水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与高血糖AMI组比较,正常血糖AMI组MPO、IL-1β、IL-6水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,高血糖AMI组NF-κB和TNF-α表达明显升高(P<0.01)。与高血糖AMI组比较,正常血糖AMI组NF-κB和TNF-α表达明显降低(1.231±0.245vs1.743±0.383,1.109±0.247vs1.624±0.413,P<0.01)。结论：高血糖介导的炎性因子MPO、IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α表达增加可能是加重急性心肌缺血损伤的主要机制之一。

关键词：
NF-κB
心肌梗死
心肌缺血
肿瘤坏死因子α
过氧化物酶
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高血糖可加重急性心肌缺血患者发病率和病死率。同时高血糖也是导致局部或广泛心肌缺血预后更差的重要危险因素。与正常血糖患者比较,高血糖患者发生急性心肌缺血概率增加,且预后更差[1]。故高血糖加重心肌缺血组织损害的观点已无可争议,但其机制尚未完全明确。近年来研究发现,炎性反应在高血糖加重急性心肌缺血损伤中扮演重要作用。研究结果证实,缺血心肌组织中髓过氧化物酶(MPO)、NF-κB、TNF-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6被认为是加重心肌损害的主要炎症指标。本研究比较由链脲佐菌素(STZ)诱导高血糖大鼠与正常血糖大鼠在急性心肌缺血损伤后MPO、IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α表达,初步探讨高血糖介导的炎性反应加重急性心肌缺血的损伤作用机制。

1、材料与方法

1.1实验动物分组

选择SPF级雄性SD大鼠48只,体质量280～320g,8周龄,由重庆医科大学医学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(渝)2017-0001。按随机数字表法分为假手术组、高血糖合并急性心肌梗死(AMI)组(高血糖AMI组)、正常血糖AMI组,每组16只。

1.2实验试剂

STZ粉剂;MPO试剂盒(江苏省南京建成生物科技有限公司);IL-1β、IL-6、酶联免疫吸附试剂盒(江苏省南京建成生物科技有限公司);鼠源TNF-α抗体、兔源NF-κB抗体(美国Sigma);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1高血糖模型制作

制备糖尿病大鼠模型:大鼠禁食8h以上,左下腹腔内注射STZ20mg/kg,24h后再次腹腔注射STZ35mg/kg。动态观察大鼠症状和体征变化,应用罗氏血糖仪测定尾尖静脉血糖,当随机血糖>16.9mmol/L,且伴有多饮、多尿、体质量下降等表现者判定为高血糖制模成功,连续监测血糖7d。假手术组和正常血糖AMI组大鼠腹腔注射等体积灭菌的枸橼酸/枸橼酸盐缓冲液。

1.3.2AMI模型制作

高血糖模型成功后连续监测血糖7d,当血糖稳定后,麻醉大鼠,打开胸腔暴露心脏,剪开心脏包膜,确定左冠状动脉前降支,找到起始部予穿线结扎,阻断冠状动脉血流,造成心肌缺血。心肌缺血标志为心肌颜色由红变灰白,心电图显示ST段立即抬高,6h后,麻醉处死大鼠,取材缺血处心肌。

1.3.3心功能检测

麻醉大鼠安静后仰位固定,经颈总动脉插管至左心室,接心电图,记录左心室舒张末期压(LVEDP)、LVEF、左心室压力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

1.3.4心肌缺血组织MPO活性测定

心肌缺血6h后,每组随机取6只大鼠,处死后取缺血处心肌组织(假手术组取左侧心肌组织)超声波粉碎(30s,3次),4℃12000r/min离心10min,保持温度20～25℃,取上清液于分光光度计下立即扫描,检测吸光度(A)值,随后按试剂盒说明书操作。

1.3.5酶联免疫吸附法测定IL-1β和IL-6表达

心肌缺血6h后,每组取缺血区心肌组织100mg与RIPA裂解液按1mg〯10μl于冰上匀浆后提取总蛋白,取总蛋白60μl行BCA蛋白定量。再次每组称取100mg,加入9倍体积4℃生理盐水,超声波细胞粉碎机制成10%组织匀浆,4℃冷冻离心机离心,4000r/min离心10min,取上清液,分别按试剂盒说明书操作,在不同波长酶标仪中测定A值。

1.3.6心肌缺血组织NF-κB和TNF-α表达测定

各组分别取6只心肌缺血组织,与十二烷基硫酸钠裂解液按一定比例迅速研磨后冰上裂解10min,玻璃匀浆器匀浆,4℃冷冻离心机以12000r/min离心5min,收集上清液提取总蛋白(NF-κB进行核蛋白提取),应用BCA法行蛋白定量。取样品加等体积2×电泳样品缓冲液混合,以20～25μg蛋白/每泳道上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转膜至硝酸纤维膜,5%脱脂奶粉(溶解于2×PBS)封闭,室温孵育60min,加入相应一抗[兔抗大鼠NF-κB(1〯600)或羊抗大鼠TNF-α(1∶500)],4℃缓慢摇振孵育过夜;应用PBS-T(1LPBS中加入1ml吐温-20)洗膜5次×10min,加入辣根过氧化物酶标记的二抗[山羊抗兔(1〯7000),兔抗山羊(1〯7000)],室温避光孵育60min;PBS-T洗膜5次×10min,化学增光显色剂进行显色,拍摄滤膜照片,采用HPIAS.1000高清晰度彩色病理图文分析系统进行图像分析,然后获取各组平均A值,使用目的蛋白与甘油醛-3-磷酸脱氢酶比值作为相对表达量。

1.4统计学方法

采用SPSS13.0统计软件,正态分布的计量资料以x±s表示,采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组腹腔注射STZ前后血糖水平比较

假手术组与正常血糖AMI组腹腔注射STZ后血糖水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较,高血糖AMI组腹腔注射STZ后血糖水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,表1)。

表1各组腹腔注射STZ前后血糖水平比较(x±s,mmol/L,n=16)

2.2各组心功能指标比较

假手术组无心功能受损。与假手术组比较,高血糖AMI组LVEDP明显升高,+dp/dtmax和-dp/dtmax明显降低,有统计学差异(P<0.05)。与高血糖AMI组比较,正常血糖AMI组LVEDP明显降低,+dp/dtmax和-dp/dtmax明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,表2)。

表2各组心功能指标比较(x±s,n=6)

2.3各组MPO和IL-1β以及IL-6水平比较

各组MPO、IL-1β、IL-6水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,高血糖AMI组MPO、IL-1β、IL-6水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与高血糖AMI组比较,正常血糖AMI组MPO、IL-1β、IL-6水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,表3)。

表3各组MPO和IL-1β及IL-6水平比较(x±s,n=6)

图1各组NF-κB和TNF-α表达

3、讨论

目前已明确高血糖是急性心肌缺血发病和加重的独立危险因素之一,其不仅可以诱发急性心肌缺血发作、加重心功能负荷、还可以加重心肌缺血损伤[2]。临床研究中发现,高血糖患者全身和局部炎性反应增强,血清炎性标志物较非高血糖患者显著升高。而且还发现,高血糖患者体内多种组织可见炎性反应指标超表达,故认为高血糖介导的炎性反应是加重心肌损伤的重要因素[3,4,5]。本研究发现,与假手术组比较,高血糖AMI组LVEDP明显升高,+dp/dtmax和-dp/dtmax明显降低。与高血糖AMI组比较,正常血糖AMI组LVEDP明显降低,+dp/dtmax和-dp/dtmax明显升高,与既往研究一致[6]。

高血糖合并急性心肌缺血发生后机体内炎性反应被激活,细胞内外炎性因子显著增加,其炎性反应被认为是加重急性心肌缺血损伤的重要因素之一。MPO在炎性反应中占有重要地位,一般通过MPO测定可从炎症方面证实心肌缺血加重的机制。有研究发现,MPO活性程度的增加与实验大鼠心肌缺血后心功能受损、心肌梗死面积呈正相关[7]。有研究发现,姜黄素在一定剂量下可显著降低大鼠心肌缺血组织MPO活性,也可明确减少心肌损害和心肌梗死面积[8]。上述研究结果表明,MPO活性与心肌缺血组织损伤严重程度密切相关。本研究结果显示,与假手术组比较,高血糖AMI组MPO活性明显升高。与高血糖AMI组比较,正常血糖AMI组MPO活性明显降低,相对应的心功能损害、MPO活性相一致。故可以认为高血糖介导的炎性反应因子MPO活性增加是加重心肌缺血损伤的重要因素之一。

本研究结果还显示,与假手术组比较,高血糖AMI组IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α表达明显升高,相应的心功能也随之恶化。国内有研究发现,采用不同剂量灯盏乙素干预心肌缺血再灌注损伤大鼠,IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α表达随剂量增加而降低,相应的心功能损害、心肌梗死面积和炎性因子表达均下降[9]。而有学者研究发现,使用炎性因子促动剂时NF-κB、TNF-α表达明显增加,相反心功能损害、心肌梗死面积明显加重,甚至实验大鼠病死率显著增高。

NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6均具有多效性作用,其为促炎性细胞因子,在高血糖介导的炎性反应中扮演重要作用。既往研究证实,NF-κB和TNF-α通过多种途径参与心肌缺血损伤:能促进炎性因子生成,并诱导白细胞聚集;激活心肌细胞内磷脂酶A2,刺激血管激活因子释放;促进血管内皮细胞合成和IL-1、IL-8、细胞间黏附分子1等表达,同时也促进白细胞黏附于毛细血管壁[10]。而NF-κB是启动炎性反应的关键细胞因子之一,在急性心肌缺血发生发展中发挥重要作用,目前机制大致有以下几个方面:增加兴奋性氨基酸的神经毒性;增加细胞钙离子超载;同时刺激内皮细胞表达;诱导凋亡基因超表达,促进细胞凋亡[11]。研究证实,NF-κB可诱导下游炎性因子直接损伤血管内皮细胞,从而影响血管通透性,促进炎性反应增加,产生炎症物质大量增加,抑制血栓调节因子蛋白C、蛋白S系统,导致血管收缩,从而加重心肌缺血损伤[11]。本研究结果显示,高血糖AMI组NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6较假手术组和正常血糖AMI组明显升高,故我们推测高血糖加重急性心肌缺血损伤的因素可能与上述炎性因子明显升高相关。

综上研究所述,高血糖介导的炎性因子MPO、IL-1β、IL-6和NF-κB、TNF-α表达在急性心肌缺血后心肌组织中显著升高。相对应大鼠心功能显著下降,心肌缺血程度显著增加与上述炎性因子测定指标一致。因此我们在实际工作中遇到高血糖患者时,需注意炎性反应对心肌缺血加重损害的影响,给予相应药物干预,从而使更多患者受益,增加新的治疗靶点。

王剑,唐刚,司良毅.高血糖介导炎性反应加重大鼠急性心肌缺血损伤的作用[J].中华老年心脑血管病杂志,2020,22(09):970-973.