近期有研究发现，在血管重塑所致视网膜病变的过程中，发现了一种新的转化生长因子β1信号通路调节物质，即LRG1[7,10]，它通过结合转化生长因子TGF-β1的辅助受体内皮糖蛋白，在存在TGF-β1的条件下，激活了促血管生成的信号转导通路[1]，从而促进内皮细胞的有丝分裂，促进了血管的新生，LRG1的血管生成活性不仅局限于眼睛，在许多其他生物过程中也扮演着重要的角色，其中包括肿瘤和免疫反应[2]。然而，LRG1在缺血性卒中后，对脑内新血管生成的过程仍没有完全阐明，并且其新生血管的潜在机制尚不清楚。

材料与方法

1.实验动物

本实验中选择北京维通利华实验动物技术有限公司：SPF级，雄性，C57BL/6小鼠，体质量20～25g。饲养于室温控制在23℃、湿度50%的实验室中。

2.动物模型的建立

小鼠称重后水合氯醛麻醉（350mg·kg-1)，采用Longa的改良线栓法建立小鼠pMCAO模型。小鼠头左尾右固定于镜下鼠板后充分暴露颈部，备皮消毒后，于胸骨柄及下颌骨间取长约1cm正中切口。分离颈总动脉并于其近心端挂线备用，结扎颈外动脉，于结扎线近心端挂两条线备用，于颈内动脉系一活结暂时阻断血流，后系活结于颈总动脉上。将鼠板逆时针旋转90℃，在颈外动脉上距分叉1～1.5mm用显微剪剪小口，将标记好的线栓由此切口插入颈总动脉中。后将鼠板转回，将线栓从颈总动脉拔出至颈动脉分叉稍尾侧后将线栓转向滑入颈内动脉，解开颈内动脉活结后继续将线栓插入颈内动脉，进线长度约为距颈动脉分叉处10.0±0.5mm，略感阻力时，于颈外动脉上系线固定线栓，松颈总动脉活结。观察无出血后缝皮。

3.实验动物分组

随机分为两组：假手术组；pMCAO组，假手术组不插入尼龙线栓其余操作同模型组。每组小鼠分别于手术后相应的时间点，即术后12h,24h,48h,3d,7d时取材，取材前进行Longa评分。

4.pMCAO神经功能缺损评分

实验动物评分标准如下：0分，无神经损伤症状；1分，提尾时鼠病灶对侧前肢伸展不全；2分，鼠行走时向瘫痪侧转圈；3分，鼠向瘫痪侧倾倒；4分，无自主活动或意识丧失。小鼠深度麻醉后灌流至右心耳流出澄清液体，灌注100ml4%多聚甲醛后，断头取脑，苏木精-伊红染色观察（n=4)，免疫组化观察（n=4），蛋白印迹观察（n=4）。

排除标准：(1)Longa评分0分及4分小鼠；(2)实验时间点前死亡的小鼠；(3)取脑时发现为蛛网膜下腔出血或脑出血小鼠。

5.苏木精-伊红染色

小鼠深度麻醉后打开胸腔，暴露心脏，从左心室插管，剪开右心耳，灌注100mL0.9%NaCl冲洗血管内血液，至右心耳流出液体澄清后灌注100ml4%多聚甲醛，断头取脑后将小鼠脑组织置于4%多聚甲醛中固定48h后，脱水、透明、石蜡包埋，相邻切片进行苏木精-伊红染色。

染色方法：二甲苯I、II依次5～10min洗片，无水乙醇I、II各1～3min,95%及80%乙醇各1～3min后蒸馏水洗1min，苏木精液染色5～10min，洗去染色液，1%盐酸-乙醇1～3s,流水冲洗10～15min，蒸馏水洗1～2min,0.5%伊红液染色1～3min，蒸馏水稍洗，后80%及95%乙醇2～3min，无水乙醇I、II3～5min，二甲苯I、II、III各3～5min，中性树胶封固。

6.免疫组化染色

所制脑组织切片常规进行脱蜡、水化，3%过氧化氢阻断后蒸馏水洗3遍，置于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA）中进行抗原修复，冷却至室温后0.01M磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersaline,PBS)(pH=7.4）中漂洗三次，擦片后组织切片置于湿盒中，滴加一抗（LRG11:25,TGF-β11:200),4℃湿盒孵育过夜，PBS洗3遍后滴加抗鼠二抗，室温孵育20min,PBS洗3次并滴加染色剂二氨基联苯（diaminodiphenylbenzidine,DAB），显色1～3min镜下观察，待出现阳性细胞染色较深而背景未染色或浅染色时，快速浸泡于PBS缓冲液中终止染色，自来水冲洗2min后苏木精液中复染使细胞核着色，显微镜下观察苏木精复染情况，而后常规脱水透明，中性树胶封片，于烤箱内过夜烘干后观察。

主要试剂：辣根过氧化物酶显色剂DAB（北京中杉金桥，中国），EDTA(pH9.0sigma，美国），鼠抗LRG1单克隆抗体（Santa，美国），鼠抗TGF-β1(Origene，美国），免疫组化抗鼠二抗（北京中杉金桥，中国）。

镜下观察结果：每张切片随机选择五个视野在40×放大倍数下照相，免疫组化阳性结果表现为淡黄色或蓝色背景下出现的深黄色点或团块。图像结果应用Image-Proplus软件计算其光吸收值（opticaldensity,OD）值。

7.蛋白质印迹（Westernblotting)

小鼠于手术后相应时间点，迅速断头取脑，分离缺血侧脑组织，置于液氮速冻，-80℃保存备用。每个待用脑组织加入含蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF）的RIPA蛋白裂解液（RIPAlysisbuffer,IP)(5μL·mg-1）,研磨后进行涡旋混匀，4℃静置30min。离心后提取上清。测定总蛋白浓度并确定上样量。根据样本蛋白总体积按4:1的比例加入5×上样缓冲液，充分混匀，99℃水浴锅10min使蛋白变性，室温冷却后分装-20℃保存备用。组装凝胶配置装置，灌入12%分离胶后水封，室温静置1h，倒去上方液体，加入5%浓缩胶，迅速插入梳子，室温凝固30min。每个胶孔等质量上样100μg蛋白，两侧胶孔分别加入3μL蛋白标记（Maker），连接电源，80V电压电泳30min，改为120V电泳80min。电泳完毕后，组装转膜装置，连接电源300mA恒流，转膜70min。聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜于5%的脱脂奶粉TBST溶液内室温封闭1h后一抗稀释液（LRG11:100,TGF-β11:1000)4℃孵育过夜。次日用洗膜缓冲液（trisbufferedsalinetween,TBST）溶液漂洗PVDF膜三次，每次10min。随后孵育加入碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠二抗（1:5000）室温1.5h。再次用TBST溶液漂洗PVDF膜三次，每次5min。PVDF膜加入现配化学发光试剂ECL发光剂（electrochemiluminescence,ECL)(A和B两种试剂等体积混匀）显色后放入凝胶成像仪进行曝光，至出现特异性条带后停止曝光。

主要试剂：RIPA蛋白裂解液（AR0105-100）（博士德，中国），蛋白酶抑制剂PMSF(sigma,美国），蛋白Marker(Fermatas，美国），PVDF膜(Millipore，德国)，鼠抗LRG1单克隆抗体（Santa，美国），鼠抗TGF-β1(Origene，美国），碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠二抗（博士德，中国），ECL发光试剂盒（博士德，中国）。

8.统计学方法

应用SPSS20.0软件实验数据结果为±s，组间差异采用单因素方差分析的方法来检验LRG1和TGF-β1之间的关系，统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.对照组及pMCAO模型小鼠脑缺血后脑组织的形态学变化（图1.A-F)

图1A-F对照组及pMCAO模型后小鼠脑缺血炎症细胞浸润级神经元缺失情况

pMCAO组可见大量炎性细胞浸润以及神经元的缺失，而对照组则未见明显炎性细胞浸润或神经元的缺失。

2.LRG1在对照组及pMCAO模型小鼠脑缺血后的表达及分布（图2.A-F)

为了验证LRG1在pMCAO小鼠脑缺血模型中是否起到血管再生的作用，从时间及空间上均检测到了LRG1的表达。免疫组化结果提示LRG1蛋白主要为胞浆性表达。LRG1表达于微血管的内皮细胞中，在星形胶质细胞中也有表达。

GpMCAO模型中LRG1蛋白在梗死后不同时间点表达的条带以及内参表达情况（见图2)

图2HWestern-blotting条带分析柱状图

相比于对照组发现，LRG1蛋白的表达在12h开始逐渐增多(P<0.05），至第3天达到高峰，保持一个高于对照组的水平直到pMCAO模型后的第7天。(P<0.05).

3.TGF-β1在pMCAO模型小鼠脑缺血后的表达及分布（图3.A-F)

图3A-FTGF-β1在对照组及pMCAO模型中的分布情况

免疫组化结果提示TGF-β1主要分布于细胞核。与假手术组相比，在pMCAO小鼠模型的缺血半暗带中存在TGF-β1的表达。图片显示TGF-β1主要表达于星形胶质细胞，少量表达于血管内皮细胞。

图3GpMCAO模型中TGF-β1蛋白在梗死后不同时间点表达的条带以及内参表达情况

图3HWestern-blotting条带分析柱状图

讨论

卒中可分为缺血性、颅内出血性以及蛛网膜下腔出血性卒中几种[3]。它是人类致死和致残率的危险因素。卒中后的侧支循环开放和恢复缺血半暗带的血流灌注是保护缺血脑组织的关键[4]。然而，卒中后的血管新生机制仍是目前研究的热点之一。Nakajima等[6]曾报道，相比于正常小鼠的视网膜，LRG1在小鼠眼睛视网膜新生血管的重构过程中表达明显增高。研究观察还发现，LRG1的表达不仅局限于小鼠视网膜，也在小鼠的脉络膜血管系统中有表达[14]。与数据表示一致，研究报道LRG1在正常成人视网膜、乳腺、皮肤和肠血管中低水平表达[6,16]。基于之前的研究，LRG1被认为是一种新型的新生血管调节因子，其表达几乎完全仅限制于血管系统[8]。因此，推测LRG1可能在卒中后的血管生成中起调节作用。为了验证这一猜测，该研究检测在pMCAO小鼠脑缺血模型后的12h,24h,48h,3d和7d,LRG1及TGF-β1的表达变化。结果显示LRG1及TGF-β1蛋白的表达在缺血后12h时明显增高并且在3d达高峰，直至第7d出现相比对照组下降的趋势。(图2.G图2.H；图3.G图3.H)上述结果提示，LRG1可能在小鼠pMCAO模型缺血后促进了侧支循环的生成。这种侧支循环可以使缺血半暗带的血流得以恢复，这将减少脑组织的缺血后损伤。

LRG1表达于细胞的不同部位，包括胞核、胞浆、质膜、细胞外基质、血清和脑脊液[7,9]。Alsina-Sanchis等[12]报道，LRG1分布于整个脑内。LRG1的染色结果揭示，LRG1标志性表达于微血管中，并且表达LRG1的细胞显示出与星形胶质细胞有相似的细胞形态学[11]。就目前的发现显示，在小鼠脑缺血模型中，LRG1在细胞胞浆的表达占据着主导地位(图2.A-F)。LRG1不仅表达在脉管系统，也在星形胶质细胞细胞中表达。这个结果与先前的研究结果一致[11]。

本课题中，图2.A-F证实LRG1的表达较假手术组增多，且表达部位以星形胶质细胞和微血管的内皮细胞为主，并随着缺血时间的延长，阳性细胞的表达呈递增趋势，直至缺血后3天达峰值。并发现LRG1蛋白在第12h相比于假手术组明显增高，在第3天时达到最高值，并且直至第7天开始出现下降趋势（图2.G，图2.H）因此，本文猜想，在pMCAO小鼠脑缺血模型中，LRG1主要在内皮细胞和星形胶质细胞的表达明显升高，并且分泌到细胞外环境中，然后调节血管的再生从而保护缺血后的脑组织。

TGF-β是一类分泌型多肽信号分子[1,9]。TGF-β1目前已经被应用到哺乳动物的相关生理与病理过程，其能够控制细胞增殖以及分化，因此在胚胎与肿瘤发展以及免疫调节等过程中起到一定的作用[13]。

在一般的哺乳动物里，现在仅发现了三种亚型，也就是TGF-β1、β2和β3[9,12]。因为超家族成员的同源性，所以TGF-β的每一个亚型在一些生物反应过程里显示出近乎相同作用，但是TGF-β1所占有的比例较高，且最有活性，为结缔组织成长的助动因子，同样为上皮再生以及造血系统的主要影响因素[15]。

本实验图3.G、图3.H证实TGF-β1在pMCAO缺血后的表达变化情况，且随着缺血时间延长呈增加趋势，脑组织缺血半暗带可能能起到一定的保护性作用，TGF-β1作为LRG1的下游信号通路，可以继续激活Smad1/3/5,从而促进VEGF的生成，促进侧支的生成[13]。TGF-β1在中枢神经中主要表达于星形胶质细胞中，在血管内皮细胞中也有表达[15]。

Wang等[10]报道，在患有糖尿病视网膜病变人群的玻璃中，促进了LRG1蛋白的表达，TGF-β1蛋白水平也明显上调。此外，在眼底新生血管的模型中，增加LRG1的基因表达，TGF-β1mRNA的转录水平也相应的提高[14,15]。也有报道，LRG1增强了TGF-β1在Lewis大鼠肺癌细胞中的影响[5]。另外，在非小细胞肺癌中，LRG1是TGF-β1信号通路的一个上游调节因子[4,5]。并且，LRG1与TGF-β1在高内皮小静脉中有着密切的关系[17]。这些数据都表明，LRG1可能是TGF-β1信号通路的调节器。这提示进一步研究，在小鼠pMCAO脑缺血模型中，LRG1是否通过TGF-β1信号通路来促进血管新生。在pMCAO缺血模型中，现研究发现TGF-β1蛋白在第12h相比于对照组明显增高，在第3天时达到最高值，并且直至第7天开始出现下降趋势（图3.G图3.H）。LRG1的表达增高，同时TGF-β1的表达也明显升高。这提示，在MCAO小鼠脑缺血模型中，LRG1可能通过上调TGF-β1信号通路来促进血管的再生，从而保护缺血脑组织受损。

Wang等[10]证明，在TGF-β1存在的条件下，LRG结合ALK1，即TGF-β信号通路的受体，然后进一步激活下游递质，Li等[5]，该递质可以通过诱导和分泌血管生成因子，如VEGF和Ang-2[1,15]，来促进侧支的形成。血管生成因子，VEGF和Ang-2能够促进内皮细胞增殖，这将是血管新生的来源[11,12]。由此作者假设，LRG1在内皮及胶质细胞中的表达上升并且在脑缺血后的血管新生过程中分泌增多。另外，LRG1结合TGF-β1受体，ALK1同时激活下游的Smads通路[21]。然后缺血的脑组织分泌血管生成因子，包括VEGF和Ang-2，从而促进血管的新生，使侧支循环建立。

当前研究提示在pMCAO小鼠脑缺血模型中，LRG1的表达在星形胶质细胞中增高且来自细胞的分泌，同时可以诱导一系列血管生成因子，如VEGF和Ang-2的表达，通过调节TGF-β1通路来促进侧支的形成。至于LRG1调节脑缺血后的血管新生具体机制，仍需进一步的研究和证实。

实验中免疫组化和Western–blotting均显示LRG1、TGF-β1在pMCAO小鼠脑缺血模型中的表达变化呈一致，变化趋势相似，多次重复试验结果证实这一观点。这与之前相关研究指出的在脑缺血后LRG1与TGF-β1的表达存在一定相关性。但本课题并未继续探讨下游信号转导系统也是弊端之一。

本课题通过对相关实验结果进行分析证实LRG1与TGF-β1的表达呈一致性，即缺血后的12h明显上升，在3d时达高峰，逐渐下降至基线。这对脑缺血后侧支循环的建立，能减轻脑梗死后的缺血-再灌注损伤，挽救缺血半暗带，减少梗死的面积起到支持作用且意义深远。

参考文献：

[9]卢昌均,曾鉴源.TGF-β与缺血性脑卒中[J].中国现代药物应用,2014,8(8)246-247.

曹靖玮,钟镝,李国忠.小鼠脑缺血后LRG1与TGF-β1的表达研究[J].脑与神经疾病杂志,2020,28(10):595-600.