据世界卫生组织统计，在全球范围内60岁以上的老年人中，男性中约9.6%、女性中约18%患有骨性关节炎[1,2]。一项流行病学调查显示，中国50岁以上人群，膝骨性关节炎患病率为22.1%，男性患病率约9.39%，女性患病率约12.75%[3]。最新指南也指出，2020年起，骨性关节炎将成为全球第四大致残疾病，给家庭及社会造成巨大的经济负担[4]。目前，骨性关节炎的药物治疗主要为口服药物及关节腔注射，但现有药物更多的是缓解症状、延缓病情，且多数不良反应较多不适合长期使用[5]，中晚期骨性关节炎患者的药物治疗效果欠佳，不得不考虑进行关节置换手术治疗[6]。因此研究开发特异性非手术治疗骨性关节炎药物来拮抗骨性关节炎疾病中软骨细胞凋亡，进而修复软骨损伤已成为研究热点。

骨性关节炎的发病机制尚不完全明了，但有研究表明线粒体功能紊乱在骨性关节炎的发生发展中发挥重要的作用。线粒体功能障碍，线粒体膜电位改变，膜通透性增加，释放活性氧诱导细胞氧化应激的发生[7]，并释放细胞色素C激活caspase-3，最终促发软骨细胞的线粒体凋亡途径，导致软骨细胞凋亡[8,9]。研究发现，2型糖尿病与骨性关节炎的关系紧密，糖尿病所致的高糖环境及炎症反应会加速软骨的破坏[10,11,12]。采用转化医学模式，课题组尝试将治疗2型糖尿病的药物运用于骨性关节炎的治疗当中。葡萄糖依赖性促胰岛素多肽是由十二指肠K细胞合成分泌的一种胃肠激素，同时也是一种治疗2型糖尿病的新型药物[13]。GIP受体的分布很广泛，包括软骨细胞膜上也含有GIP受体。BOLLAG等[14]研究发现GIP对骨源性细胞也有合成代谢作用，但GIP对软骨细胞的相关作用还有待研究，推测GIP受体可作为治疗骨性关节炎的潜在靶点。由于人体内的活性GIP易被二肽基肽4(DPP-4)分解，在血浆中的半衰期仅有4min[15]，较短的半衰期难以起到治疗的目的，因此选择GIP的新型替代物DAla2GIP，该药物是将GIP第二位的左旋丙氨酸用右旋丙氨酸替代，增加了对DPP-4的抵抗能力，使其有效半衰期延长至5.0-6.0h。

此次实验以培养的软骨细胞为基础，通过设立多个样本处理组，采用线粒体膜电位检测及Annexin-VFITCkit细胞凋亡检测、激光共聚焦显微镜下细胞钙超载测定及ELISA法测细胞色素C水平的结果，来探讨DAIa2GIP保护软骨细胞的生物学分子机制。

1、材料和方法

1.1设计细胞学实验观察。

1.2时间及地点

实验于2019年4月至2020年1月在山西医科大学第二医院骨科骨与软组织损伤修复山西省重点实验室完成。

1.3材料

1.3.1实验细胞及主要试剂

DAla2GIP、pro3GIP(强耀生物科技有限公司，中国上海)；白细胞介素1β(PeproTech，美国)；胎牛血清(天杭生物，中国杭州)；DMEM/F12培养基、BA0533、SABC免疫组化染色试剂盒(SA1022)(博士德生物，中国武汉)；胰蛋白酶(含EDTA)、青链霉素混合液、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(不含EDTA)、Fluo-4,AM(F8500)、HBSS)(H1046)、H1070、PluronicF-127(P6790)(索莱宝生物，中国北京)；线粒体膜电位与细胞凋亡检测试剂盒(C1071S，碧云天生物，中国上海)；大鼠细胞色素C酶联免疫分析(m1003185，酶联生物，中国上海)。

1.3.2主要实验仪器

T-25细胞培养瓶(康宁，美国)；二氧化碳培养箱(Thermo，美国)；倒置显微镜(BX51,Olympus，日本)；流式细胞仪(sysmex，日本)；倒置显微镜(DMi8,Leica，德国)；激光共聚焦显微镜(TCS-SP8,Leica，德国)；多功能酶标仪(SpectraMaxM5,MolecularDevices，美国)。

1.4实验方法

1.4.1提取细胞及培养

实验选取SD大鼠出生7d的幼鼠肋软骨细胞[山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(晋)2019-0004]。幼鼠麻醉处死，体积分数75%乙醇浸泡10min消毒。解剖幼鼠，仔细分离胸廓，尽量去除附着的肌肉、胸膜等软组织，无菌PBS漂洗3次去除残留的软组织。加入0.20%Ⅱ型胶原酶，于二氧化碳培养箱中消化1.5h,PBS漂洗3次，换用0.05%Ⅱ型胶原酶继续消化4h。低速离心，无菌PBS漂洗反复3次，尽量去除杂质后，用含1%双抗、体积分数10%血清的DMEM培养液重悬浮细胞，后接种入T25培养瓶，待细胞融合至75%-85%进行传代培养。

1.4.2细胞分组

取第3代细胞，细胞融合至70%-80%时在原培养基的基础上做不同处理，分为6组：(1)正常对照组：原培养基；(2)白细胞介素1β诱导组：加入白细胞介素1β(10μg/L);(3)白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组：加入白细胞介素1β(10μg/L)，加入DAla2GIP(100pmol/L);(4)白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP(GIPR拮抗剂)孵育组：加入白细胞介素1β(10μg/L)，加入DAla2GIP(100pmol/L)，加入pro3GIP(100pmol/L);(5)DAla2GIP孵育组：加入DAla2GIP(100pmol/L);(6)pro3GIP孵育组：加入pro3GIP(100pmol/L)。6组均在二氧化碳培养箱中孵育48h后进行后续实验。

1.4.3SABC免疫组织化学法鉴定软骨细胞

(1)制片：取第1代细胞制作细胞爬片；(2)封闭：5%BSA封闭液，37℃环境孵育30min;(3)一抗孵育：滴加一抗(兔抗鼠，Ⅱ型胶原)，4℃过夜；(4)羊抗兔IgG:PBS洗涤3次后，滴加羊抗兔IgG,37℃环境孵育30min;(5)SABC:PBS洗涤2次后，滴加SABC37℃环境孵育30min;(6)显色：选用DAB作为显色剂；(7)苏木素复染1.5min，脱水、透明；(8)树脂封固；(9)倒置显微镜观察，放大倍数×100。

1.4.4线粒体膜电位检测及Annexin-VFITCkit(磷脂酰丝氨酸外翻分析)细胞凋亡检测

(1)流式细胞学技术：(1)取第3代细胞分组培养48h后，将原培养液吸出转移至15mL无菌离心管待用，无菌PBS洗涤3次后，用不含EDTA的胰蛋白酶将细胞消化至细胞接触分离，轻轻拍打培养瓶底部使细胞漂浮；(2)培养瓶中加入原培养液(可搜集漂浮的细胞，同时中和胰蛋白酶防止细胞过度消化)，1000×g离心，小心收集沉淀，无菌PBS重悬细胞并计数；(3)取5×104-1×105个重悬的细胞，再次1000×g离心，去除上清液，加入AnnexinⅤ-FITC结合液188μL重悬；(4)然后加入Mito-TrackerRedCMXRos染色液2μL、AnnexinⅤ-FITC5μL，混匀；(5)避光室温孵育20-30min;(6)立即于流式细胞仪上机检测，红色荧光为Mito-TrackerRedCMXRos(Ex/Em:350/461nm)，绿色荧光为AnnexinⅤ-FITC(Ex/Em:492/520)。

(2)荧光显微镜：(1)取培养的第2代软骨细胞待细胞融合至80%-90%，用含EDTA的胰蛋白酶消化贴壁细胞为细胞悬液，计算细胞浓度后以5×104L-1传代接种至24孔板，分组处理48h;(2)吸出培养液，无菌PBS洗涤3次；(3)加入AnnexinⅤ-FITC结合液188μL，轻轻摇晃至铺满孔底；(4)加入AnnexinⅤ-FITC5μL，轻轻摇晃至混匀；(5)加入Mito-TrackerRedCMXRos染色液2μL,Hoechst33342染液5μL，轻晃混匀；(6)避光室温孵育20-30min;(7)立即于荧光显微镜下观察，Mito-TrackerRedCMXRos染液为红色荧光，AnnexinⅤ-FITC染液为绿色荧光，Hoechst33342染液为蓝色荧光；(8)分别在放大40,100及400倍视野下观察，并于放大400倍视野内计数各色阳光下细胞数量。

1.4.5激光共聚焦显微镜测钙超载

(1)取培养的第2代软骨细胞待细胞融合至80%-90%，传代接种至专用培养皿中，分组处理48h;(2)配置2mmol/L的Fluo-4,AM/二甲基亚枫溶液，待使用前加入PluronicF127;(3)将2mmol/L的Fluo-4,AM/二甲基亚枫溶液用HBSS稀释，以制备4µmol/L的Fluo-4,AM工作液；(4)将Fluo-4,AM工作液加入培养皿中至覆盖培养皿底层，记录加入工作液的体积，37℃下培养20min;(5)加入工作液5倍体积分数1%胎牛血清的HBSS，然后继续培养40min;(6)用HEPESbuffersaline将细胞洗涤3次，培养皿中加入适量该溶液，37℃下继续培养10min;(7)激光共聚焦显微镜检测(激发波长：494nm，发射波长516nm);(8)由低倍镜下观察，选好视野后调整至20倍视野下观察，选取至少5个形态良好的软骨细胞作为观察对象，每15s拍照1张连续拍摄15min，计算每个细胞的平均荧光强度。

1.4.6ELISA法测细胞色素C含量

(1)裂解：取第3代细胞分组孵育48h后，通过反复冻融破坏细胞(液氮中速冻5min，立即放入37℃水浴锅5min，反复5次)，释放内部成分；(2)收集：2000-3000r/min，离心20min后仔细收集上清液，弃去沉淀；(3)加样：设置标准孔及样本孔；(4)加酶：除空白孔外，每孔加入酶标试剂100μL;(5)温育：封膜板封板，37℃温育60min;(6)洗涤：去除封膜板，弃液体，反复洗涤5次；(7)显色：每孔加入显色剂A50μL，然后加入显色剂B50μL,37℃避光15min;(8)终止：每孔加入终止液50μL;(9)测定：多功能酶标仪测量A值；(10)换算：以标准品结果绘制标准曲线，根据测量样本A值计算样本的细胞色素C浓度。

1.5主要观察指标

(1)软骨细胞鉴定结果；(2)软骨细胞凋亡发生线粒体膜电位检测及Annexin-VFITCkit(磷脂酰丝氨酸外翻分析)细胞凋亡检测结果；(3)软骨细胞钙超载情况。

1.6统计学分析

采用IBMSPSS20.0统计学软件进行统计学数据分析，计量资料数据以±s描述，根据实验设计采用单因素方差分析LSD多重比较，P<0.05认为差异有显著性意义。

2、结果

2.1软骨细胞鉴定结果

采用SABC免疫组织化学方法观察细胞培养分离情况，见图1。对培养的第1代细胞进行实验，以Ⅱ型胶原抗体作为一抗孵育，辅以苏木精复染，可见Ⅱ型胶原可被显影(图1A)，对比细胞核染色(图1B)结果所示，表明实验提取细胞为软骨细胞，实验选用第1代软骨细胞进行。

2.2细胞凋亡检测结果

2.2.1流式细胞技术

为检测DAla2GIP对软骨细胞的保护效应，利用线粒体膜电位及Annexin-VFITC技术手段检测软骨细胞发生线粒体途径的凋亡，见图2。

(1)软骨细胞线粒体膜电位保持程度：白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组(93.15±0.07)%明显高于白细胞介素1β诱导组(81.00±1.48)%(P<0.01)；白细胞介素1β诱导组与白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(81.65±2.26)%比较差异无显著性意义(P>0.05)，且两组均低于正常对照组(95.10±0.42)%(P<0.01)；正常对照组、DAla2GIP孵育组(94.95±0.49)%及pro3GIP孵育组(92.95±0.35)%比较均差异无显著性意义(P>0.05)。

(2)软骨细胞凋亡率：白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组(1.05±0.05)%明显低于白细胞介素1β诱导组(3.85±0.55)%(P<0.01)；白细胞介素1β诱导组与白细胞介素1β+DAla2GIP+pro-3GIP孵育组(3.25±0.25)%比较差异无显著性意义(P>0.05)，且两组均高于正常对照组(0.95±0.15)%(P<0.01)；正常对照组、DAla2GIP孵育组(1.7±0.4)%及pro3GIP孵育组(1.1±0.4)%比较均差异无显著性意义(P>0.05)。

2.2.2荧光显微镜

图3为各处理组细胞荧光显微镜下观察。Mito-TrackerRedCMXRos染液为红色荧光，标记保持线粒体膜电位的活细胞，且随着线粒体膜电位的减弱到丧失红色荧光而逐渐减弱；AnnexinⅤ-FITC染液为绿色荧光，标记发生凋亡的细胞；Hoechst33342染液为蓝色荧光，标记细胞核。

(1)软骨细胞线粒体膜电位保持程度：白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组(93.36±2.34)%明显高于白细胞介素1β诱导组(89.86±1.76)%；白细胞介素1β诱导组与白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(89.07±1.40)%比较差异无显著性意义，且两组均低于正常对照组(95.43±1.31)%(P<0.01)；正常对照组、DAla2GIP孵育组(93.9±2.28)%及pro3GIP孵育组(93.5±1.56)%比较均差异无显著性意义(P>0.05)。

(2)软骨细胞凋亡程度：白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组(6.63±2.34)%明显低于白细胞介素1β诱导组(10.13±1.76)%(P<0.01)；白细胞介素1β诱导组与白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(10.9±1.40)%比较差异无显著性(P>0.05)，且两组均高于正常对照组(4.5±0.75)%(P<0.01)；正常对照组、DAla2GIP孵育组(6.1±2.29)%及pro3GIP孵育组(6.5±1.56)%比较均差异无显著性意义(P>0.05)。

2.3DAla2GIP孵育逆转白细胞介素1β诱导的软骨细胞钙超载情况

见图4。结果以荧光强度表示，白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组(52.59±3.00)较之白细胞介素1β诱导组(62.72±6.29)显著降低(P<0.01)；白细胞介素1β诱导组与白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组(62.87±3.75)比较差异无显著性意义(P>0.05)，两组较之正常对照组(51.79±3.76)均显著增高(P<0.01)；正常对照组、DAla2GIP孵育组(51.18±2.61)及pro3GIP孵育组(52.26±6.29)3组之间比较均差异无显著性意义(P>0.05)。

2.4软骨细胞线粒体细胞色素C的释放

为检测DAla2GIP对损伤软骨细胞的保护效应，利用ELISA实验检测各组软骨细胞中细胞色素C的水平，见表1。相比较于白细胞介素1β诱导组，白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组显著降低(P<0.01)；白细胞介素1β诱导组与白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP孵育组比较差异无显著性意义(P>0.05)，且两组相比较于正常对照组均显著增高(P<0.01)；正常对照组、DAla2GIP孵育组及pro3GIP孵育组3组之间比较均差异无显著性意义(P>0.05)。

表1|各组细胞色素C水平

3、讨论

骨性关节炎是以关节滑膜炎症、软骨退化、软骨下骨改变、半月板损伤、肌腱和韧带损伤为特征多病因、多表型的慢性全关节疾病[16]，骨性关节炎的发病原因及机制目前尚不完全清楚，普遍认为骨性关节炎是多因素造成的包括：年龄、性别、炎症、创伤以及遗传等因素[17]。

目前，已应用于临床的药物分为口服药物及关节腔注射药物，这些药物主要作用是缓解症状延缓病情发展,多数不良反应明显，并且有部分药物的使用尚存在争议[18]。

随着新技术、新手段的发展，以及对骨性关节炎的不断深入研究，对于治疗骨性关节炎的药物研究也在高速的发展。新型药物主要集中在以下几个方面：(1)控制关节炎症的药物、以关节软骨为靶点的药物、缓解疼痛的药物(现有临床用药多不能长期服用)以及以软骨下骨为靶点的药物，这些药物大多处于临床前期阶段[19]，这些新型药物的研究现已成为研究的热点领域。流行病学调查显示，骨性关节炎与2型糖尿病关系密切，2型糖尿患者中有49%最终发生骨关节病变，而骨性关节炎中，发现软骨组织出现糖代谢异常的现象[20]。肠促胰素是一类在食物等营养物质刺激下由肠道的内分泌细胞分泌产生的激素，包括胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)和GIP，大量实验表明其可以直接或间接影响骨代谢，并且这个影响是有利的，为此曾有学者提出“肠-骨轴”的概念[21]。研究表明，GIP通过GIPR激活cAMP信号通路以及Ca2+-三磷酸肌醇信号通路，对骨代谢相关指标、骨密度及骨矿含量、骨微结构以及骨组织形态学等都有良性作用[22,23]。前言部分曾提到，有学者证明在软骨细胞有GIPR的表达，结合GIP对于骨代谢的良性作用，GIPR的激活很可能对软骨细胞同样具有保护作用，这是此次实验的主要内容。

细胞凋亡是对内、外界的刺激产生的程序性应答，线粒体膜通透性改变在这个过程中起到关键的作用[24,25]。当相应的刺激信号传导入细胞内，P53被激活，会与线粒体膜上的Bcl-2家族成员相互作用，下调该家族中Bcl-2等抑制凋亡因子，上调Bax等促凋亡因子[26]，继而导致线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放，使得线粒体膜电位下降，造成线粒体肿胀以及钙超载的发生，同时包括细胞色素c(Cytc)、线粒体促凋亡蛋白Smac、凋亡诱导因子等诸多因子释放入细胞质内，触发Caspase级联反应，使细胞发生凋亡[27,28]。

图1|免疫组织化学染色荧光显微镜鉴定软骨细胞(×100)

图注：A为Ⅱ型胶原荧光染色图片；B为苏木精细胞核染色

图2|各组细胞流式细胞学、线粒体膜电位及Annexin-VFITC检测结果

图注：1：正常对照组：2：白细胞介素1β诱导组；3：白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组；4：白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP(GIPR拮抗剂)孵育组；5:DAla2GIP孵育组；6:pro3GIP孵育组。图A为各组细胞流式细胞学结果，横坐标表示Annexin-VFITC染色凋亡细胞百分比，纵坐标表示线粒体膜电位测试活细胞膜电位保持度；B,C分别是线粒体膜电位及Annexin-VFITC检测的统计直方图，与正常对照组比较，aP<0.01，与白细胞介素1β组比较，bP<0.01；与白细胞介素1β+DAla2GIP组比较，cP<0.01

图2|各组细胞流式细胞学、线粒体膜电位及Annexin-VFITC检测结果

图注：1：正常对照组：2：白细胞介素1β诱导组；3：白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组；4：白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP(GIPR拮抗剂)孵育组；5:DAla2GIP孵育组；6:pro3GIP孵育组。图A为各组细胞流式细胞学结果，横坐标表示Annexin-VFITC染色凋亡细胞百分比，纵坐标表示线粒体膜电位测试活细胞膜电位保持度；B,C分别是线粒体膜电位及Annexin-VFITC检测的统计直方图，与正常对照组比较，aP<0.01，与白细胞介素1β组比较，bP<0.01；与白细胞介素1β+DAla2GIP组比较，cP<0.01

图3|各理组细胞荧光显微镜观察、线粒体膜电位及Annexin-VFITC检测结果

图注：1：正常对照组：2：白细胞介素1β诱导组；3：白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组；4：白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP(GIPR拮抗剂)孵育组；5:DAla2GIP孵育组；6:pro3GIP孵育组。图A为各组Mito-TrackerRedCMXRos染液及AnnexinⅤ-FITC染液荧光显色；B,C分别是线粒体膜电位及Annexin-VFITC检测的统计直方图，与正常对照组比较，aP<0.01，与白细胞介素1β组比较，bP<0.01；与白细胞介素1β+DAla2GIP组比较，cP<0.01

图4|各组软骨细胞钙超载情况

图注：1：正常对照组：2：白细胞介素1β诱导组；3：白细胞介素1β+DAla2GIP孵育组；4：白细胞介素1β+DAla2GIP+pro3GIP(GIPR拮抗剂)孵育组；5:DAla2GIP孵育组；6:pro3GIP孵育组。图A为各组激光共聚焦显微镜下钙成像(×200);B为显示各组软骨细胞钙超载的平均荧光强度的统计直方图，与正常对照组比较，aP<0.01，与白细胞介素1β组比较，bP<0.01；与白细胞介素1β+DAla2GIP组比较，cP<0.01

此次实验围绕DAla2GIP通过保护线粒体达到拮抗白细胞介素1β对软骨细胞的破坏展开，通过设立6个不同处理组，进行线粒体膜电位及Annexin-VFITCkit细胞凋亡检测、激光共聚焦显微镜测定钙超载及ELISA法测定细胞色素C含量等实验。比较各组之间的差异可以发现：(1)DAla2GIP+白细胞介素1β共孵育组线粒体膜电位保持程度明显高于白细胞介素1β诱导组，而凋亡率、钙超载程度及细胞色素C前者均显著低于后者；(2)DAla2GIP+白细胞介素1β+pro3GIP共孵育组各个实验数据与白细胞介素1β孵育组相对应实验数据无显著差异，且两组线粒体膜电位保持程度低于正常对照组，而凋亡率、钙超载程度及细胞色素C均高于正常对照组；(3)DAla2GIP+白细胞介素1β共孵育组、正常对照组及pro3GIP孵育组相对应实验数据无显著差异。由此认为DAla-2GIP可以拮抗白细胞介素1β诱导的软骨细胞线粒体功能障碍。DAla2GIP通过与GIPR结合使之激活，通过一定的信号传导，抑制线粒体孔道的开放，线粒体膜电位得以保持，且内部促凋亡因子，如细胞色素C等不会被释放，最终抑制凋亡的发生。同时，也证明DAla2GIP及其拮抗剂pro3GIP的安全性，两种试剂在实验浓度并不会对软骨细胞造成明显的不良影响。另外，ATP的合成依赖于线粒体膜的完整性，当线粒体膜电位发生改变、线粒体内嵴变短甚至消失以及线粒体基质颗粒密度下降(后两者均因线粒体肿胀造成)，ATP的合成发生障碍[29]，当细胞内大量线粒体功能障碍时，呼吸链便不能维持，进一步促进细胞的凋亡。此次实验同样发现，白细胞介素1β组的线粒体膜电位去极化异常，而DAla2GIP孵育后明显改善线粒体膜电位的损伤。

此次实验只探讨了DAla2GIP拮抗白细胞介素1β诱导线粒体途径的凋亡，造成软骨细胞损伤的分子生物学原因还有很多其他途径，例如细胞自噬等，有待进一步探讨；同时，实验只进行了体外细胞的相关研究，但动物体内的软骨细胞是一个更加立体结构，研究表明在体细胞与离体培养细胞存在一定的差异，对于活体动物实验需要进一步探讨。

综上所述，实验结果证实DAla2GIP可以有效拮抗白细胞介素1β诱导的离体小鼠软骨细胞线粒体途径所致的凋亡，其发挥作用的机制可能是DAla2GIP与细胞膜表面的GIPR结合后，通过一定的信号传导，可以维持线粒体膜电位的稳定，达到拮抗白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡的效果。

作者贡献：王越为实验设计、实施，王宇泽为实验指导、评估，王新军、袁银鹏辅助实验实施。

经费支持：该文章接受了“山西省优秀青年基金项目(201901D211505);国家自然科学基金(31200728)；山西医科大学第二医院博士启动基金(20120408)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验方案经山西医科大学动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

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基金:山西省优秀青年基金项目(201901D211505),项目负责人:王宇泽;国家自然科学基金(31200728),项目负责人:王宇泽;山西医科大学第二医院博士启动基金(20120408),项目负责人:王宇泽.