随着人们生活方式的改变,糖耐量受损已成为全球性的公共卫生问题[1]。IGT的诊断标准为空腹血糖6.1～7.0mmol/L,餐后2h血糖(2hplasmaglucose,2hPG)为7.8～11.1mmol/L。国际糖尿病联盟调查[2]表明,2019年全球20～79岁成年人中约有7.5%的人处于IGT阶段,预计到2045年IGT患者将增加至5.48亿人,占成年人口的8.6%,而中国是IGT患者最多的国家。IGT的发病因素有很多,包括遗传因素、胰岛素抵抗、胰岛素分泌缺陷、炎性反应、氧化应激等原因[3,4]。IGT是心血管疾病、卒中、外周血管疾病的高危因素,也是发展为2型糖尿病的必经阶段,IGT阶段是血糖调节的唯一可逆阶段[5,6]。目前IGT的干预方式主要有生活方式干预和药物干预。然而,IGT患者的药物治疗标准、药物长期干预成本、药物不良反应及治疗终点仍不明确[7]。经皮耳穴-迷走神经刺激则可避免上述弊端。刺激部位选取脾、胃、肝、肾等耳穴分布的“内脏代表区”——耳甲区,且该区是耳部唯一有迷走神经分布的区域[8]。前期基础实验[9]表明,taVNS能改善自发性糖尿病大鼠(zuckerdiabeticfatty,ZDF)的血糖;临床研究[10]亦表明taVNS可显著改善IGT患者的血糖,但其具体作用机制尚未完全阐明。因此,本实验旨在探讨taVNS对IGT模型大鼠血糖调节及下丘脑、肝脏、骨骼肌中胰岛素受体(insulinreceptors,INR)表达的影响,为临床taVNS治疗IGT提供实验依据。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

36只雄性Wistar大鼠,体质量180～200g,由北京维通利华实验动物有限公司提供,生产许可证号:SCXK(京)-2016-0006。饲养环境为通风、光照12h/12h,温度(21±2)℃,相对湿度(50±10)%,大鼠自由摄食和饮水。适应性饲养1周后,采用随机数字表法将大鼠随机分为空白组、模型组、耳缘-非迷走神经刺激(transcutaneousauricularnone-vagusnervestimulation,tnVNS)组、taVNS组,每组9只。本实验通过中国中医科学院针灸研究所动物实验伦理审查,伦理审批号:D2018-11-21-1。实验过程严格遵守科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的相关规定及“3R”原则。

1.2主要仪器及试剂

电子秤(JJ500型,常州双杰测试仪器厂),罗氏活力型血糖检测仪和血糖试纸(瑞士罗氏),HANS-100A电针仪(南京济生医疗科技有限公司),MatrxVIP3000型异氟烷气化器(美国Midmark),全自动多功能酶标仪(美国Thermo),DH4000A型电热恒温培养箱(天津泰斯特公司),蛋白Marker、蛋白质电泳及转膜系统(美国Bio-Rad),微量加样器(美国Sigma)。

链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,美国Sigma),高糖高脂饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司),异氟烷(河北一品制药股份有限公司),胰岛素(insulin,INS)、胰高血糖素(glucagon,GC)、糖化血红蛋白(glycosylatedhemoglobin,GHbA1c)酶联免疫吸附测定试剂盒(上海蓝基因生物技术有限公司),BCA快速蛋白定量试剂盒、ECL超敏发光液(北京普利莱基因技术有限公司),山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP(美国Jackson),INR单克隆抗体(英国Abcam)。

1.3造模方法

改进Leng等[11]及陈珊珊等[12]建立IGT模型的方法,本研究采用高糖高脂饲料饲养配合腹腔注射低剂量STZ复制IGT模型大鼠。正常组予基础饲料(碳水化合物65.42%、蛋白质22.47%、脂肪12.11%)饲养,其余3组予高糖高脂饲料(参考H10045配方,碳水化合物35%、蛋白质20%、脂肪45%)饲养。饲养5周后,模型组、tnVNS组和taVNS组禁食、不禁水12h,腹腔注射2%STZ溶液(0.1mol/L,pH=4.4柠檬酸缓冲液溶解)20mg/kg,正常组给予腹腔注射相同剂量柠檬酸缓冲液。注射3d后,进行口服葡萄糖耐量实验,禁食12h后尾静脉取血用快速血糖仪测FPG,予50%葡萄糖2g/kg灌胃,2h后尾静脉取血测其2hPG,参照相关文献[13]及本次实验正常组大鼠血糖值,设定FPG<7mmol/L、2hPG在7.8～11.1mmol/L为造模成功标准。若造模大鼠血糖没有达到IGT标准,则再次腹腔注射2%STZ溶液10mg/kg。造模第6周末模型组、tnVNS组、taVNS组大鼠均达到IGT造模标准。后续实验过程中,正常组予以基础饲料饲养,其余各组继续予以高糖高脂饲料饲养。

1.4干预方法

taVNS组电刺激部位是有丰富迷走神经分布的耳甲区,tnVNS组电刺激部位是无迷走神经分布的耳缘区。造模成功后,在2%异氟烷吸入麻醉下,将两个磁极相反的电极置于大鼠耳甲腔或耳缘的内外[14],以保证电流能够深入组织内部,并在电极和皮肤之间加用0.9%氯化钠溶液以增强导电性。连接电针仪,对taVNS组大鼠和tnVNS组大鼠连续干预4周,刺激时间为每天15:00—17:00,每次30min,疏密波,频率2Hz/15Hz,强度为2mA。见图1。正常组和模型组每日同步抓取,在2%异氟烷吸入麻醉下固定,不电针。

图1耳穴-迷走神经刺激部位示意图

1.5观察指标与检测方法

体质量及血糖测量:每2周测量1次大鼠的体质量;分别于造模前、造模后第2、4、6周,电针干预后第2、4周,尾静脉取血测量各组大鼠FPG及2hPG。

酶联免疫吸附法检测各组大鼠血浆INS、GC、GHbA1c水平:干预结束后,10%水合氯醛腹腔注射(0.4mL/100g)麻醉,大鼠断头取血,将血液移至10mL肝素抗凝管中,室温静置20min后,4℃、3000r/min离心10min,分离血浆置于-80℃冰箱保存待检,严格按照ELISA试剂盒说明书步骤进行检测,并绘制浓度标准曲线。

Westernblot法检测各组大鼠INR在下丘脑、肝脏、骨骼肌中的表达:干预结束后每组各取5只大鼠进行检测,10%水合氯醛腹腔注射(0.4mL/100g)处死大鼠,大鼠断头置于冰上,取出下丘脑,取适量后肢骨骼肌、肝脏组织,上述3种样本分装保存并标记清楚,立即放入液氮中速冻储存,待全部标本采集完成,将标本保存在-80℃冰箱中,留待检测使用。(1)蛋白抽提:预冷RIPA蛋白抽提试剂,加入蛋白酶抑制剂。取30mg组织加入500μLRIPA裂解液,电动组织匀浆器3000r/min转速进行匀浆10min,匀浆完成后在冰上孵育20min,4℃13000r/min离心20min,取上清进行蛋白定量及蛋白样本制备。(2)BCA法蛋白定量:按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作,测定蛋白浓度。(3)蛋白浓度调整:以RIPA调整蛋白浓度,样品终浓度为下丘脑2.5μg/μL,肝脏和骨骼肌各5μg/μL,加入5×蛋白样品缓冲液,95℃5min。(4)根据目的蛋白的分子量,配置10%分离胶,浓缩胶浓度为5%;下丘脑25μg/孔,骨骼肌、肝脏40μg/孔上样。电泳条件为浓缩胶恒压90V,约20min。分离胶恒压120V,通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。湿转法,转膜条件为300mA恒流;0.45μm孔径PVDF膜,转膜时间90min。转膜完成后以丽春红染色试剂对膜进行染色,观察转膜效果。将膜完全浸没于5%BSA-TBST中,室温摇床孵育1h;5%BSA-TBST稀释INR单克隆抗体(1∶1000),4℃水平摇床孵育过夜;次日洗膜,5%BSA-TBST稀释HRP标记的二抗(1∶10000)室温孵育40min后洗膜;ECL滴加到膜上后反应3min,于暗室曝光,显影2min,定影。以Imagesystemver4.0软件对图像进行灰度分析,以GAPDH为内参,计算下丘脑、肝脏、骨骼肌INR相对表达量。本检测重复3次,以平均值进行统计分析。

1.6统计学方法

采用SPSS23.0统计软件进行统计,所有数值用均值±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验。以P≤0.05为差异有统计学意义的标准。

2、结果

2.1各组大鼠体质量的比较

造模后6周,与正常组比较,模型组、tnVNS组、taVNS组大鼠体质量明显增加(P<0.001);干预4周后,与正常组比较,模型组大鼠体质量明显增加(P<0.001);干预后与模型组比较,taVNS组大鼠体质量明显降低(P<0.01),tnVNS组差异无统计学意义(P>0.05);与tnVNS组比较,taVNS组大鼠体质量有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2各组大鼠体质量比较(x−±s,9只鼠/组)

2.2各组大鼠FPG和2hPG水平的比较

造模前各组大鼠FPG值和2hPG差异无统计学意义(P>0.05);造模后6周与正常组比较,模型组、taVNS组和tnVNS组大鼠FPG和2hPG明显升高(P<0.05,P<0.001),提示造模成功。干预4周后,与正常组比较,模型组大鼠FPG和2hPG明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,taVNS组大鼠FPG和2hPG明显降低(P<0.05,P<0.01),tnVNS组差异无统计学意义(P>0.05);与tnVNS组比较,taVNS组大鼠FPG和2hPG降低(P<0.05)。见图3。

图3各组大鼠FPG及2hPG水平的比较

2.3各组大鼠血浆INS、GC、GHbA1c含量的比较

干预4周后与正常组比较,模型组大鼠血浆INS含量明显降低(P<0.001),血浆GC、GHbA1c含量明显升高(P<0.01);与模型组比较,taVNS组大鼠血浆INS含量明显升高(P<0.001),血浆GC含量明显降低(P<0.01),而tnVNS组大鼠血浆INS、GC、GHbA1c含量差异均无统计学意义(P>0.05),taVNS组大鼠血浆GHbA1c含量差异无统计学意义(P>0.05);与tnVNS组比较,taVNS组大鼠血浆INS含量明显升高(P<0.001),GC、GHbA1c含量呈降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

2.4各组大鼠下丘脑、肝脏、骨骼肌中INR表达的比较

干预4周后与正常组比较,模型组下丘脑、肝脏、骨骼肌中INR表达明显下降(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,taVNS组下丘脑、肝脏、骨骼肌中INR表达明显增加(P<0.01,P<0.05),而tnVNS组差异无统计学意义(P>0.05);与tnVNS组比较,taVNS组大鼠下丘脑、肝脏中INR表达明显增加(P<0.05,P<0.01),骨骼肌中INR表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

3、讨论

IGT属中医“脾瘅”“食郁”等范畴[15]。阴虚、肝郁、脾虚等是IGT的中医病机,其主要病变脏腑在脾胃、肾、肝等[16]。关于耳穴的记录最早可追溯到《灵枢》中关于耳与脏腑经脉的联系,“耳为宗脉之所聚也”,十二经脉的循行或直接入于耳中,或分布在耳区周围,由于经络的表里、络属关系等,刺激病变脏腑的相应耳穴可达到防治疾病的目的[17],耳穴与脏腑经络相关理论的阐述为耳穴诊治疾病奠定了中医学理论基础。临床常用调节血糖的耳穴有脾胃、肾、肝等位于耳穴内脏代表区—耳甲区的穴位,其主要依据是IGT的发病与上述脏腑密切相关[18]。

图4各组大鼠血浆INS、GC、GHbA1c含量的比较

现代医学研究[19,20]表明,耳甲区是耳部唯一有迷走神经(vagusnerve,VN)分布的区域。前期研究[21]采用神经示踪技术首次系统观察到迷走神经耳支存在直接向迷走神经感觉核—孤束核的纤维投射,为“耳穴—迷走联系理论”的提出奠定了形态学基础。taVNS的刺激部位是耳甲区,前期基础实验[22]表明taVNS可以激活孤束核内葡萄糖敏感和胰岛素敏感神经元,其中以葡萄糖抑制性反应的细胞为主。taVNS可引起ZDF大鼠短期血浆褪黑素、胰高血糖素、胰岛素、葡萄糖呈节律性释放,并对血糖、糖化血红蛋白和胰岛素具有长期的调控作用[23]。VN通过调控胃肠运动和分泌、胰腺内分泌和外分泌、肝脏葡萄糖生成及其他内脏功能来调节代谢稳态[24,25]。2016年美国食品药品管理局批准了一种新型减肥医疗器械,即通过电刺激影响人体的VN节律[26],在肥胖状态下,VN敏感性降低,刺激迷走神经可改善VN张力,改变胃肠道运动并减少胃肠道吸收热量,抑制成年人对食物摄取和甜味的渴求,降低体质量,改善糖代谢紊乱,恢复代谢稳态[27,28]。本研究结果表明,taVNS可改善IGT模型大鼠的FPG和2hPG,并降低大鼠体质量。

图5各组大鼠下丘脑、肝脏、骨骼肌INR表达的比较

支配胰腺的副交感神经节前纤维起自于迷走神经背核,并下行到胸、腹腔脏器旁节或器官内节交换神经元,其节后纤维分布到胰腺,在胰腺小叶间隔的神经节换元后,节后纤维进入腺泡的β细胞,调控INS分泌[29,30]。基于INS分泌和VN活性的相关性,有学者提出了“迷走-胰岛素系统”的概念[31]。INR是INS激活中枢神经系统和外周细胞内信号系统的必要因素[32]32],生理情况下,INS与肝细胞、肌细胞上的INR结合,通过一系列化学反应促进糖原和脂肪酸的合成,从而降低了葡萄糖的输出。IGT是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍而引发的内分泌代谢异常[33],发生IGT时,肝脏、骨骼肌等外周组织发生胰岛素抵抗,表现为糖负荷后胰岛素分泌相对不足,加之肝脏、骨骼肌等组织的胰岛素抵抗,导致餐后血糖增高[34]。本实验结果表明,taVNS可增加IGT模型大鼠INS含量,上调肝脏、骨骼肌中INR的表达。大脑是一个INS敏感器官,INR在下丘脑、嗅球、海马、小脑、杏仁核和大脑皮层广泛而有选择性地表达[35]35]。下丘脑是调节人体代谢和饮食的高级中枢,下丘脑腹内侧核有饱食中枢,腹外侧核有摄食中枢,迷走神经背核内的神经元发出的较短的神经纤维到达下丘脑,通过调节下丘脑以实现对饮食和血糖代谢活动的调节[36]36]。taVNS刺激耳甲,激活迷走神经耳支,其传入纤维到达下神经节的假单极神经元,经过传入纤维向内传入孤束核,而孤束核内的双极神经元与迷走神经背核发生突触联系,本实验研究表明taVNS可上调IGT模型大鼠下丘脑INR的表达。

综上所述,taVNS可改善IGT模型大鼠的FPG和2hPG,降低体质量,增加INS分泌,降低GC含量,增加下丘脑、肝脏、骨骼肌中INR的表达。taVNS可改善IGT向2型糖尿病转归的趋势,为IGT患者的临床治疗提供一种新方法、新选择。

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