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视神经脊髓炎相关性视神经炎实验模型的建立及应用

2020-12-31 217 上传者：管理员

摘要：视神经脊髓炎(NMO)为亚裔人群高发、神经眼科交叉、体液免疫主导的炎症性中枢神经系统星形胶质细胞病,因其高致病性、高复发风险和预后差而备受关注。NMO相关性视神经炎(NMO-ON)患者很难从常规治疗中获益,多遗留不同程度的视神经萎缩。NMO-ON研究的一个局限是实验模型的不足,故本文就NMO及NMO-ON实验模型的研究进展及应用作一综述,旨在探究NMO视功能损害的病理学机制及可能的治疗方法。

关键词：
动物实验
实验医学
实验模型
细胞实验
视神经炎
视神经脊髓炎
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视神经脊髓炎(neuromyelitisoptica,NMO)是一种神经眼科交叉、高发于亚裔人群、体液免疫主导的中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)星形胶质细胞病,以视神经炎(opticneuritis,ON)和急性横贯性脊髓炎为典型临床表现[1]。与NMO相关的特发性视神经炎称为NMO相关性视神经炎(NMO-associatedopticneuritis,NMO-ON),NMO-ON患者很难从常规治疗中获益,多遗留不同程度的视神经萎缩[2,3]。抗水通道蛋白4抗体(aquaporin-4immunoglobulinG,AQP4-IgG)的发现与确认使得NMO及NMO-ON在发病机制、诊断及治疗上取得显著的进步[4]。视神经在NMO中的特殊敏感性提示有必要研究视神经特异性NMO模型的发病机制和治疗反应。然而,目前广泛应用的NMO实验模型是建立在已有的AQP4-IgG致病作用基础上,只能部分模拟NMO病变。尤其是缺乏关注NMO-ON本身病理改变和发病机制的研究。本文将论述近年来关于NMO-ON及NMO实验模型的研究进展,期望为NMO-ON发病机制的深入了解及开发新型诊断和治疗方法提供帮助。

1、动物实验模型

1.1伴或不伴有炎症介质的AQP4-IgG诱导的动物模型

人和啮齿动物AQP4蛋白结构相似,利用人AQP4-IgG建立了基于AQP4的NMO或NMO-ON啮齿动物模型。但单一静脉输注或腹腔被动注射AQP4-IgG不足以产生NMO样病变及临床特征[5],主要是因为AQP4-IgG无法通过完整的血-脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)进入CNS,故早期该类模型的建立多采用破坏或绕过BBB和在CNS产生抗原特异性T细胞的策略。如AQP4-IgG经完全弗氏佐剂(completeFreund'sadjuvant,CFA)处理后,可破坏BBB,即可在部分大鼠体内产生NMO样致病作用[6]。其它炎症介质如趋化因子(如CXCL2)和促炎性细胞因子(如白细胞介素-6和干扰素-γ等)在纹状体中的立体定向注射可诱导CNS炎性前状态,促进AQP4-IgG进入注射半球并在注射部位附近诱发NMO样病变。该模型为研究单个细胞因子或趋化因子在NMO和NMO-ON大鼠模型中损伤起始和演变中的作用提供了机会[6,7]。Sagan等[8]则论述了AQP4特异性T细胞诱导小鼠瘫痪及视觉系统损伤模型的详细构建过程及其意义。

此外,以实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)为基础,采用AQP4-IgG系统注射法构建了大鼠主动和被动NMO/EAE模型[7,9],该模型原理为利用EAE破坏BBB并营造CNS炎性环境,随后注射AQP4-IgG。不同点在于主动NMO/EAE模型将AQP4-IgG腹腔注射到预先用CFA乳化的牛髓鞘碱性蛋白免疫的大鼠[9];被动NMO/EAE则将在体外抗原活化产生的反应性T细胞再输注正常大鼠,接着腹腔注射AQP4-IgG[9]。如腹腔注射纯化的人AQP4-IgG或杆状病毒表达法产生的高亲和力抗AQP4单克隆抗体(monoclonalantibodies,mAbs),可导致EAE模型Lewis大鼠视交叉、脊髓和脑干出现严重的NMO-ON和NMO样病变[10]。Jones等[11]则利用此类NMO大鼠模型证明了CXCR2抑制剂可阻断EAE时中性粒细胞向脊髓的迁移,但对该模型的炎症或AQP4损伤没有明显的减轻作用。受限于大鼠、AQP4-IgG需求量大、实验结果易受EAE本身病理变化影响和脊髓内的病变呈现离散的小斑片状等是NMO/EAE模型的缺陷。因此,与以往在EAE基础上构建的模型不同,Yick等[12]使用细菌预处理的小鼠腹腔注射高剂量(4mg/d,8d,每只小鼠32mg/d)AQP4-IgG,也成功构造出AQP4-IgG诱发的补体无关的脊髓病变,包括星形细胞病变、神经炎症、脱髓鞘和轴突损伤/丢失。Lee等[13]在小鼠L5～L6鞘内注射AQP4-IgG和补体,构建NMO/EAE小鼠新模型,模拟NMO患者临床表现与病理改变之间的关联性。

另一种NMO或NMO-ON动物模型的构造方式则是在大鼠鞘膜内或者脑内局部注射AQP4-IgG,不需要人补体及炎症前状态且避开BBB的屏障作用。如Lewis大鼠反复鞘膜内注射人AQP4-IgG,可建立缓解复发NMO病变的过程[14]。将纯化的AQP4-IgG慢性注入大鼠脑脊液,也可导致脊髓和视神经出现NMO和NMO-ON样病变[15]。但重复性及诱发率低、实验者操作技术要求高、AQP4-IgG需求量更大等限制了使用大鼠构建此类模型。

1.2AQP4-IgG和人补体共同诱导的动物模型

与大鼠不同的是,AQP4-IgG并不能激活小鼠体内本身活性较低的补体系统,且小鼠血清对经典补体系统的激活具有天然较强的抑制作用[16],故人类补体的注入是建立此类小鼠模型的必要条件。该类实验模型使得无炎症前状态的AQP4-IgG介导的发病机制中补体激活的研究和临床前治疗方法的测试成为可能。在缺乏T细胞的裸鼠脑内注射AQP4-IgG和人的补体也能产生和野生型鼠相类似的NMO病灶,提示本模型不需要T细胞参与[17]。利用该类实验模型证明了中性粒细胞[18]及抗体依赖性细胞毒性[19]在NMO或NMO-ON发病过程中的关键病理作用。Zhu等[20]利用脑内AQP4-IgG和人补体注射构建的小鼠NMO模型证明补体C5特异性单链抗体C5B3中和补体激活途径中的C5,预防AQP4和星形胶质细胞的丢失,减少脱髓鞘、炎症浸润和膜攻击复合物的形成。Zhang等[21]利用同类方法构建的NMO大鼠模型证明C16肽联合血管生成素-1可通过改善炎症环境来减轻NMO动物模型的进行性失明和瘫痪。

Matsumoto等[22]将AQP4-IgG阳性患者血清直接注射到SD大鼠的视神经鞘内,首次建立了NMO-ON模型。该类模型的病变局限于ON,排除其它病灶的干扰,为探讨NMO-ON的作用机制和评价其潜在的治疗作用提供了有价值的实验模型。如CD59敲除鼠视神经病理改变明显加重,提示补体调节因子在NMO-ON模型中的重要作用[16]。受此类研究方法影响,近期也有学者将AQP4-IgG阳性血清注入大鼠视神经蛛网膜下腔,构建一种视神经和视觉功能缺陷的NMO-ON模型,首次对活体NMO-ON动物模型的视觉功能和视神经变化进行纵向研究,创新性地用以探讨视神经结构及视功能的进行性变化[23]。

1.3AQP4-IgG阴性转基因鼠模型的建立

1.3.1TCR转基因小鼠模型

用AQP4胞外环免疫的致病性AQP4反应性T细胞建立小鼠AQP4-IgG血清阴性NMO模型。AQP4特异性T细胞分化为Th17表型,转入野生型小鼠,即构建特异性T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)转基因小鼠模型,出现NMO样表现,如尾肢无力,病理改变包括T细胞浸润和在脑、脊髓和视神经的脱髓鞘。因此,即使在没有AQP4-IgG的情况下,AQP4反应性T细胞在触发小鼠NMO样反应中也起着关键作用[24]。

1.3.2MOG特异性BCR/TCR转基因小鼠

通过在C57BL/6基因背景下建立能在视神经内自发产生炎症的转基因小鼠,在理解ON的免疫发病机制方面取得了显著进展。Bettelli等[25]首先构建少突胶质细胞糖蛋白(myelinoigodendrocyteglycoprotein-immunoglobulinG,MOG)特异性TCR转基因鼠和特异性B细胞受体(Bcellreceptor,BCR)转基因鼠杂交形成的双转基因的“2D2”小鼠模型,具备表达MOG35-55的TCR的T细胞大于98%、自发形成ON、模拟体内B细胞和T细胞免疫应答等特点,是目前研究NMO-ON免疫病理及视功能改变的热点动物模型,该类模型能帮助认识出现NMO典型症状但AQP4-IgG血清阴性的NMO或NMO-ON患者致病性。该模型缺点是未发现血管周围AQP4-IgG和补体成分的沉积、粒细胞浸润等[24],并且对于2D2小鼠视神经的优先靶向性还没有令人满意的答案。但该模型制备不受实验室及操作者技术水平影响,模型成功率较高的优势。因此,双MOG转基因小鼠尽管不能完全复制NMO病理学特征,但其有助于了解抗原特异性B细胞在调节自身反应性T细胞致病性方面的功能[25]。与MOG特异性BCR和TCR双转基因小鼠相似,用AQP4特异性BCR和TCR转基因小鼠建立AQP4-IgG阴性免疫鼠模型有助于阐明免疫介导的脱髓鞘发生机制。但只有60%的实验动物表现出NMO样病理特征,包括大脑、视神经和脊髓的T细胞浸润和脱髓鞘[24,26]。总之,在转基因小鼠模型中检测和操作视神经的炎性脱髓鞘是神经眼科免疫学研究的一个非常有价值的资源。

2、离体组织实验模型

用含有NMO患者AQP4-IgG的血清或纯化的AQP4-IgG等处理体外培养的鼠脊髓、视神经或海马切片,可构建NMO的离体组织或器官模型,用于NMO或NMO-ON的病理机制研究或治疗药物筛选。第一个离体NMO器官模型是由Verkman的小组构建的[27],在该模型中,横断脊髓切片在多孔的跨孔支架上培养数天,当切片暴露于带有补体的AQP4-IgG中1～3d时,会发生NMO样病变。这类模型的主要局限性在于不能提供有关该疾病全身效应的信息及不能评估BBB在NMO发病中的作用。然而,其具有NMO和NMO-ON的其他病理特征[6],如视神经或视网膜培养物暴露于AQP4-IgG和补体可导致视神经和视网膜中AQP4和GFAP的表达显著减少[28,29,30],这种病理过程可明显地被溶酶体酸化或内吞抑制剂阻止。因此,AQP4-IgG被动转移诱导的视神经和视网膜病理改变是不依赖于补体的[29]。Tradtrantip等[31]则利用NMO脊髓切片模型证明重组IgG1-Fc六聚体对NMO病理形成过程中的预防作用。

3、细胞实验模型

细胞实验模型主要用于研究基于AQP4-IgG介导的星形胶质细胞病变,可用于筛选维持星形胶质细胞存活、阻断AQP4-IgG介导的星形胶质细胞表型改变和细胞死亡的药物作用。构建方式包括从不同组织直接获取星形胶质细胞培养或用质粒转染构建能稳定表达不同AQP4的细胞模型。Kinoshita等[32]首次证明,NMO患者血清中AQP4-IgG通过经典的补体依赖途径诱导大鼠星形胶质细胞坏死,为模拟在NMO发展过程中自身抗体介导的星形胶质细胞的丢失提供了细胞模型。Sun等[33]开发了一种稳定表达人M23-AQP4的中国仓鼠肺成纤维V79细胞的NMO治疗药物的高通量筛选模型,用于鉴定AQP4-IgG和AQP4结合的小分子抑制剂,并提出中药成分异粉防己碱通过阻断AQP4-IgG与AQP4的结合降低NMO星形胶质细胞的细胞毒性。Hinson等[34]报道AQP4及其连接的谷氨酸转运体-2的内化需要AQP4-IgG与AQP4和星形胶质细胞Fcγ受体结合,该实验结果为开发治疗NMO或NMO-ON的新药物提供了上游靶点证据。近年来也开发出抑制补体依赖性细胞毒性(complement-dependentcytotoxicity,CDC)的细胞模型[31]。由于AQP4-IgG能识别NMO中AQP4的胞外结构域(extracellulardomains,ECDs),因此用抗AQP4的mAbs也建立了小鼠NMO细胞模型。杆状病毒表达法可产生两个抗AQP4-mAbs,称为E5415A(识别M1和M23AQP4亚型)和E5415B(仅识别M23亚型)。E5415A通过增强星形胶质细胞表面AQP4簇形成所触发的M1和M23的内吞作用诱导表达AQP4的星形胶质细胞降解,而E5415B的损伤明显减轻。这项研究表明,抗AQP4-ECD抗体能够交联多个AQP4阵列,形成一个AQP4大簇,导致AQP4内吞和溶酶体降解[35]。

4、结语

本文从细胞、离体组织及动物等不同层面论述了NMO及NMO-ON的实验模型的建立及应用,相关实验模型的构建已为NMO-ON和NMO相关的发病机制、开发有效治疗等方面做出重大贡献。但复杂的病理学和视觉系统的特殊性导致了难治性NMO-ON及其实验模型的构建。因此,在NMO实验模型基础上开发更特异性、能直接评价活体动物的视功能和视神经形态的NMO-ON实验模型需要进一步的研究。期望本文能为未来NMO和NMO-ON的发病机制、诊断及治疗等研究提供帮助。

韩梦雨,王志军,金明.视神经脊髓炎相关性视神经炎实验模型的建立及应用[J].国际眼科杂志,2021,21(01):53-56.