引言Introduction

肝纤维化是各种原因导致的肝损伤和炎症，在组织修复过程中肝脏细胞外基质代谢失衡，发生异常增多和过度沉积的病理过程，最终可导致更严重的后果——肝硬化。近年来的证据表明，纤维化的发生是高度动态过程，同时具有进展和逆转潜能，因此采取有效的治疗手段可阻止甚至逆转肝纤维化进程。

干细胞移植是目前治疗肝损伤的一个新的研究方向，骨髓间充质干细胞具有自我更新和多系横向分化的潜能，在体外可诱导分化为肝细胞，在体内可归巢到损伤肝脏，但既往的研究表明其作用有限，如何提高间充质干细胞移植对肝纤维化的逆转能力是目前研究的热点[1]。脯氨酰寡肽酶(prolyloligopeptidase,POP)是一种能特异性水解多肽链中脯氨酸残基羧基端肽键的丝氨酸蛋白酶，肝脏是目前发现的POP活性最高的组织，POP存在于肝细胞和肝内Kupffer细胞内，研究证实POP通过间接或直接作用参与肝纤维化进程，例如可抑制肝星状细胞活化[2]、通过水解调节Tβ4-AcSDKP轴，调控肝内巨噬细胞和肝星状细胞功能等[3,4]，但目前关于POP作用机制的研究较少。

该研究建立转POP基因的骨髓间充质干细胞体系，并将转染成功后的骨髓间充质干细胞注入肝纤维化模型大鼠体内，观察其治疗四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化的作用，并阐明其在肝纤维化治疗中的部分机制。

1、材料和方法Materialsandmethods

1.1设计

随机对照动物实验。

1.2时间及地点

实验于2018年1月至2019年12月在蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心完成。

1.3材料

1.3.1实验动物

雄性SD大鼠40只，3月龄，体质量180-200g，由合肥蜀山实验动物中心提供，随机选取5只入选正常对照组，30只用于构建大鼠肝纤维化模型，剩余5只用于提取和分离骨髓间充质干细胞。

1.3.2实验试剂

DMEM培养液(Invitrogen公司)；体积分数为10%胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶(宝泰克生物技术有限公司)；PBS(自制)；四氯化碳液(太原化工厂)；花生油(鲁花5S压榨一级花生油)；透明质酸酶和Ⅲ型前胶原放射免疫分析试剂盒(上海抗晶生物工程有限公司)；携带POP和绿色荧光蛋白基因的慢病毒(RattusPOPVirus)及空载病毒(LV5-NCVirus)，由上海吉玛基因化学技术有限公司合成；反转录PCR试剂盒、real-timePCR试剂盒(大连TaKaRa公司)；转化生长因子β抗体(BioworldTechnology)。

1.4实验方法

1.4.1慢病毒过表达载体的制备

根据PubMed提供的大鼠POP基因序列(Prep,NM＿031324)，筛选和构建携带POP和绿色荧光蛋白基因的慢病毒(RattusPOPVirus)及空载病毒(LV5-NCVirus)，经酶切、电泳及测序验证，证实POP慢病毒过表达载体构建成功后，进行慢病毒大规模包装与滴定。

1.4.2大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养

在无菌条件下分离SD大鼠股骨与胫骨，剪去两端，使用注射器吸取DMEM培养基，轻轻将骨髓腔内容物吹入培养瓶，加入Ficoll分离液分离单个核细胞，接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中，当细胞融合时，用胰蛋白酶消化传代，细胞传至第4代备用。

1.4.3过表达POP骨髓间充质干细胞体系的建立

按照吉玛基因重组慢病毒操作手册，选取不同的病毒感染复数(1,20,50,100)进行感染预实验，荧光显微镜下观察感染效率，最终选取感染复数值为20。将一定数量的状态良好的骨髓间充质干细胞接种于24孔板，在37℃培养箱中过夜，随后按照产品说明书进行感染操作，加入慢病毒或空病毒感染细胞，37℃培养箱中培养；24h后吸去病毒稀释液，换入500μL新鲜培养基，37℃培养箱中培养；48h后RT-PCR检测过表达效率并通过荧光显微镜观察慢病毒感染情况。

1.4.4动物模型的制备与分组

35只SD雄性大鼠随机选取5只入选正常对照组，其余30只采用10%四氯化碳花生油溶液皮下多点注射法制备慢性肝纤维化模型，剂量为5mL/kg，每周一和周四腹腔注射，共注射8周。

将上述造模成功的大鼠随机均分为模型损伤组(n=10)、骨髓间充质干细胞组(n=10)、过表达POP骨髓间充质干细胞组(n=10)，此后骨髓间充质干细胞组经鼠尾静脉输注1×109L-1的骨髓间充质干细胞1mL；过表达POP骨髓间充质干细胞组在相同时间等剂量给予过表达POP基因的骨髓间充质干细胞；模型对照组则给予等剂量注射生理盐水，每周一注射1次，共注射3次，第3周末取材。

1.4.5血清学检查

各组大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉，然后固定于手术台上，开腹后行下腔静脉取血5mL，用全自动生化仪检测血清谷丙转氨酶、白蛋白水平，放射免疫法检测透明质酸酶和Ⅲ型前胶原水平。

1.4.6苏木精-伊红染色法观察组织病理变化

抽血完成后血管钳阻断下腔静脉，剪取动物肝脏左叶，并给予实验动物安乐死(动物实验中遵循国际实验动物护理和使用指南的建议)。剪取的动物肝脏用体积分数10%甲醛固定，石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色镜检观察肝组织病理变化。按下述标准评判肝纤维化程度[4]：“-”无成纤维细胞增生(0分)；“+”汇管区扩大，有少量成纤维细胞增生(1分)；“++”汇管区成纤维细胞增生并向小叶内延伸，呈较窄较短的纤维条(2分)；“+++”汇管区成纤维细胞大量增生并向小叶内明显延伸，形成纤维隔伴有小叶结构紊乱(3分)。请病理医生单盲读片进行评分。

1.4.7细胞定位情况

取过表达POP骨髓间充质干细胞组大鼠肝右叶，立即冰冻切片，荧光显微镜观察过表达POP骨髓间充质干细胞在肝内的定位情况。

1.4.8Westernblot法检测转化生长因子β蛋白的表达

取各组40mg肝组织，加入1mL蛋白裂解液裂解、匀浆，12000r/min离心10min，取上清，BCA法蛋白定量，加入上样缓冲液，煮沸5min，每孔加入50μL总蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳，待溴酚蓝电泳达凝胶底部时将凝胶中的蛋白质湿转至硝酸纤维素膜上，再将硝酸纤维素膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中，室温下摇床轻摇2h进行封闭，加入大鼠抗转化生长因子β单抗，4℃孵育过夜，再与HRP偶联二抗室温孵育1h,TBST充分洗膜，ECL显色，暗室曝光，ImageLab软件对Westemblot检测结果进行灰度分析，灰度值代表蛋白相对表达量。

1.5主要观察指标

(1)各组大鼠血清谷丙转氨酶、白蛋白、透明质酸酶、Ⅲ型前胶原水平；(2)苏木精-伊红染色观察各组大鼠肝组织病理变化和肝纤维化程度；(3)各组大鼠肝组织中转化生长因子β蛋白的表达水平。

1.6统计学分析

所有数据采用±s表示，用SPSS13.0软件包进行统计学分析。多组样本间比较采用单因素方差分析方法，组间两两比较采用q检验，以α=0.05水准，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果Results

2.1POP慢病毒过表达载体的构建及慢病毒包装

筛选和构建慢病毒POP过表达载体，经NotⅠ和NsiⅠ双酶切鉴定(图1)、测序验证(图2)后，进行慢病毒包装与滴定。

2.2骨髓间充质干细胞的形态

培养2d可见散在分布、贴壁生长的细胞集落生长，换液后细胞生长迅速，7d后细胞多为双突起的长梭形或扁平形的成纤维样细胞，见图3。传代后细胞增殖迅速，一般两三天可传1代。

2.3过表达POP骨髓间充质干细胞体系的建立

转染24h后荧光显微镜可观察到POP慢病毒组和空载体组骨髓间充质干细胞中有绿色荧光蛋白表达，48h后表达量最高，见图4。

2.4RT-PCR检测转染后目的基因表达

转染48h后，荧光显微镜下观察慢病毒转染情况，然后采用RT-PCR法检测各组骨髓间充质干细胞内POPmRNA表达，结果显示POP慢病毒组骨髓间充质干细胞中POPmRNA水平为正常骨髓间充质干细胞组和空病毒组的6-8倍(P<0.01)，见图5。

2.5各组大鼠肝组织病理学观察结果

冰冻切片荧光显微镜下观察发现：过表达POP骨髓间充质干细胞组大鼠肝血管、血窦及肝小叶区域可见绿色荧光细胞，见图6，说明骨髓间充质干细胞成功在大鼠肝定植。苏木精-伊红染色发现：与模型损伤组比较，骨髓间充质干细胞组病理变化虽有所好转，但肝索仍紊乱，成纤维细胞增生不明显，肝细胞坏死、脂肪变仍严重，见图7A,B；而过表达POP骨髓间充质干细胞组肝小叶肝细胞排列整齐，小叶结构明显修复，肝细胞坏死、脂肪变明显好转，见图7C。请专业病理医师单盲读片对肝纤维化程度进行评分，见表1，与模型损伤组比较，骨髓间充质干细胞组、过表达POP骨髓间充质干细胞组损伤程度明显好转，且过表达POP骨髓间充质干细胞组恢复程度更佳，差异有显著性意义(P<0.05)。

表1|各组大鼠肝纤维化程度评分(n=10)

2.6过表达POP骨髓间充质干细胞对大鼠肝功能及肝纤维化指标的影响

如表2和表3所示，与模型损伤组比较，骨髓间充质干细胞组、过表达POP骨髓间充质干细胞组谷丙转氨酶、透明质酸酶和Ⅲ型前胶原水平明显降低(P<0.05)，白蛋白水平明显增高(P<0.05)，提示骨髓间充质干细胞移植可明显改善损伤大鼠的肝功能；与骨髓间充质干细胞组比较，过表达POP骨髓间充质干细胞组谷丙转氨酶、透明质酸酶和Ⅲ型前胶原水平也有明显降低(P<0.05)，白蛋白明显增高(P<0.05)，提示过表达POP骨髓间充质干细胞移植可更明显改善损伤大鼠的肝功能，治疗效果更佳。

表2|各组大鼠血清谷丙转氨酶、白蛋白水平变化

表3|各组大鼠血清透明质酸酶和Ⅲ型前胶原水平变化

2.7Westernblot法检测转化生长因子β蛋白的表达

如图8与表4所示，与正常对照组比较，模型损伤组转化生长因子β蛋白表达明显增高(P<0.05)；与模型损伤组比较，骨髓间充质干细胞组、过表达POP骨髓间充质干细胞组转化生长因子β蛋白表达均有不同程度的降低(P<0.05)；与骨髓间充质干细胞组比较，过表达POP骨髓间充质干细胞组转化生长因子β蛋白表达也有显著降低(P<0.05)。

表4|各组大鼠肝组织转化生长因子β蛋白变化

2.8生物相容性

间充质干细胞具有低免疫原性，由于不表达MHCⅡ类分子和B7等共刺激分子，因此具有免疫赦免特性，不刺激同种异体免疫反应。该实验将过表达POP的骨髓间充质干细胞注入大鼠体内，3周后取大鼠肝脏冰冻切片荧光显微镜下观察发现：大鼠肝血管、血窦及肝小叶区域可见绿色荧光细胞(即过表达POP的骨髓间充质干细胞)，见图6，说明骨髓间充质干细胞成功在大鼠肝脏定植。

3、讨论Discussion

肝纤维化是肝脏对于慢性损伤的修复过程，但伴随着反复损伤，肝脏细胞外基质合成与分解失衡，过量的细胞外基质常以瘢痕组织形式包围在病灶周围，从而形成肝纤维化，这一阶段若得不到有效治疗，最终会发展为肝硬化，甚至导致患者死亡。既往的研究表明，骨髓细胞移植可能加速肝组织再生过程，降低肝纤维化，改善肝功能[5,6,7]，但作者之前的研究表明单独骨髓间充质干细胞移植改善损伤肝脏的效果有限。

POP存在于肝细胞和肝内Kupffer细胞内，而肝细胞与Kupffer细胞均是肝损伤修复的关键细胞，其参与促进出生后肝脏成熟、肝切除后肝再生等生理过程。POP还参与肝损伤时炎症反应，其水平可作为人类肝硬化严重程度的指标[8]，同时它是抗肝纤维化内源性小分子肽N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)生成的关键酶[3,4]。CHEN等[3]研究发现AcSDKP水平不足在肝纤维化的发生和进展中起重要作用，而POP活性下降是内源性AcSDKP水平下降的重要原因。还有研究表明，POP通过抑制转化生长因子β信号转导和诱导过氧化物酶体增殖剂激活受体γ而减弱肝星状细胞的激活[9]。以上研究结果均提示POP是在肝细胞增殖与分化中起关键作用的酶，且POP可能是调控肝损伤修复的关键蛋白，在肝脏病理修复中发挥重要作用。

该实验将POP与骨髓间充质干细胞相结合，利用携带POP基因的慢病毒感染骨髓间充质干细胞，通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达，行RT-PCR检测转染后目的基因表达，然后将其通过尾静脉注入肝纤维化模型大鼠体内，行冰冻切片后在荧光显微镜下很容易就能找到绿色荧光蛋白标记的细胞，提示过表达POP骨髓间充质干细胞在肝内已经存活；肝组织苏木精-伊红染色发现，骨髓间充质干细胞组肝纤维化及炎症活动度较模型损伤组减轻，而过表达POP骨髓间充质干细胞组肝纤维化及炎症活动度减轻更明显，提示过表达POP骨髓间充质干细胞移植后肝损伤恢复程度更佳。通过检测肝功能指标谷丙转氨酶、白蛋白以及肝纤维化指标血清透明质酸酶和Ⅲ型前胶原，同样提示过表达POP骨髓间充质干细胞移植能更明显改善损伤大鼠的肝功能和肝纤维化情况。

图1|脯氨酰寡肽酶(POP)过表达载体双酶切鉴定

图3|分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞

图5|各组骨髓间充质干细胞中脯氨酰寡肽酶(POP)mRNA相对表达量

图2|脯氨酰寡肽酶(POP)过表达载体测序

图4|骨髓间充质干细胞内脯氨酰寡肽酶(POP)慢病毒过表达

图6|荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞定位

图7|苏木精-伊红染色观察大鼠肝组织病理变化

图8|各组大鼠肝组织转化生长因子β蛋白表达

该研究证实过表达POP骨髓间充质干细胞能抑制大鼠肝纤维化，进一步明确其作用机制。转化生长因子β的生物学作用较多，在肝星状细胞活化和肝纤维化中的作用已得到广泛证实[10]，如转化生长因子β参与肝星状细胞的活化，从而造成细胞外基质的沉积；研究发现抑制转化生长因子β表达可使肝脏纤维病变程度减轻[11,12]，这些研究均证明转化生长因子β是调控肝纤维化的重要因子。该实验采用Westernblot法检测转化生长因子β蛋白的表达探讨其改善肝纤维化的部分机制，结果显示：骨髓间充质干细胞组、过表达POP骨髓间充质干细胞组的转化生长因子β蛋白表达水平较模型损伤组均有不同程度的降低，且过表达POP骨髓间充质干细胞组更接近于正常对照组，说明过表达POP骨髓间充质干细胞可通过降低转化生长因子β表达，减少细胞外基质的沉积，抗纤维化。

目前研究认为转化生长因子β/Smads信号通路是肝纤维化的主要调控传导通路[13,14]，转化生长因子β首先与细胞膜受体结合，进一步激活其下游的信号转导分子Smads，激活的Smad2、Smad3、Smad4聚集成共同复合物或形成数个异源二聚体，进入细胞核内与特定DNA连结蛋白结合，直接调节靶基因(如胶原基因)的转录。因此，作者推测过表达POP骨髓间充质干细胞可能通过TGF-β/Smads信号通路调控肝纤维化，但需要进一步证实。

综上所述，过表达POP骨髓间充质干细胞移植可在一定程度上修复受损的肝组织，改善肝纤维化，待其作用机制、方式与基因调控等一系列后续问题研究完成后，将为肝纤维化的防治提供理论基础。

作者贡献：实验设计为张英杰，实验实施为郝晓娜，实验评估为李玉云，资料收集为许涛。

经费支持：该文章接受了“蚌埠医学院科技发展基金(BYKF1729)”及“安徽省教育厅高校科学研究重点项目(KJ2019A0391)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验方案经蚌埠医学院动物实验伦理委员会批准，批准号为2018021。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：文章统计学方法已经通过蚌埠医学院生物统计学专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

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郝晓娜,张英杰,李玉云,许涛.过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J].中国组织工程研究,2021,25(25):3988-3993.

基金:蚌埠医学院科技发展基金(BYKF1729),项目负责人:张英杰;安徽省教育厅高校科学研究重点项目(KJ2019A0391),项目负责人:张英杰