牵张成骨作为口腔颌面外科及整形外科治疗先天、后天畸形缺损等的重要整复手段在临床上具有明显优势，目前其治疗周期长、并发症相对较多等不足限制其临床广泛应用[1,2]。学者们使用了生长因子、细胞治疗、基因治疗等多种治疗手段试图促进成骨缩短治疗周期，但均停留在实验层面，上述治疗手段不仅价格昂贵，且受到伦理、安全等因素限制，短时间难以在临床广泛推广。近来研究发现，山奈酚（kaempferol,Kae）不仅具有抗氧化、抗炎、抗癌等作用，而且能够防治骨质疏松、促进成骨。本研究以多单元细胞拉伸装置为平台，对Kae处理后的小鼠骨髓间充质细胞（bonemarrowmesenchymalcells,BMMCs）施加周期性单轴牵张力，同时通过工具药抑制内源性哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammaliantargetofrapamycincomplex1,mTORC1）信号通路的表达，旨在观察Kae促进细胞张应力下成骨分化过程中该信号通路的作用，为改善牵张成骨效果提供实验基础。

1、材料和方法

1.1材料

3月龄雄性小鼠（南华大学转化研究所动物实验中心，SYXK<湘>2020-0002）。

多单元细胞拉伸装置（四川大学）；分光光度仪（Roch，瑞士）；流式细胞仪（Thermo，美国）。Percoll分离液（Phamacia，美国）；10%胎牛血清（Hyclone，美国）；LG-DMEM培养液（Gibico，美国）；二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide,DMSO)(Thermo，美国）；茜素红S染色液（索莱宝，中国）；细胞碱性磷酸酶（alkalinephosphate,ALP）试剂盒（建成，中国）；骨钙素（osteocalcin,OCN）试剂盒（RD，美国）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo，美国）；Trizol试剂盒（Gibico，美国）；反转录试剂盒（Takara，大连）。pmTOR一抗（Abcam，英国）；p-S6K一抗（CellSignaling，美国）；p-4E/BP1一抗（CellSignaling，美国），Osterix一抗（Abcam，英国）；Runx2一抗（SantaCruz，英国），GAPDH一抗（SantaCruz，英国），羊抗兔二抗（中杉，中国）。

1.2方法

1.2.1小鼠BMMCs的分离、培养及加力

无菌条件分离3月龄雄性小鼠双侧股骨和胫骨，冲出骨髓组织，利用密度梯度离心法提取BMMCs。离心后去除脂肪组织吹打成细胞悬液，加Percoll分离液后离心吸取交界面细胞层，清洗后加入10%胎牛血清及双抗的LG-DMEM培养液，吹匀后接种于培养瓶内，2～3d后更换培养基，当细胞融合达70%～80%时胰酶消化传代，选用第3代细胞进行下一步实验，每个检测指标收集8个样本行检测。按照原有方法[3]制备硅胶膜，将2×104个细胞悬液接种于硅胶膜后在37℃体积分数5%CO2培养箱培养24h后补加含10%胎牛血清的培养基10mL培养24h，更换无血清培养液同步化12h后利用多单元细胞拉伸装置（四川大学）施加10%形变量的单轴动态牵张力2h（频率为0.2Hz，工作原理示意图见图1）。

图1BMMCs细胞牵张受力示意图

1.2.2筛选合适浓度Kae

对无血清同步化后的细胞加力单元加入1、5、10、50、100μmol/L,Kae（以DMSO为溶剂）后行2h动态牵张，牵张结束后进行细胞毒性试验、细胞计数和茜素红染色。

1.2.2.1细胞毒性试验

牵张结束后加入200μLMTT溶液（5mg/mL),4h后吸除培养基，加入5mLDMSO，放在摇床上低速振荡10min后使用分光光度仪检测各加力单元490nm波长下的OD值并计算抑制率。

1.2.2.2细胞计数

牵张结束后1、4、8h，胰酶消化并悬浮细胞后利用细胞计数板在倒置显微镜下计算细胞个数。

1.2.2.3茜素红染色

牵张结束后继续在细胞培养箱中培养，2～3d换液，7d后去除培养液，PBS清洗后取出硅胶膜，修剪后置入方形培养皿中加4%多聚甲醛固定30min，弃液后再次清洗加入茜素红S染色液反应5min，弃除染液清洗至不变色后拍照。

1.2.3细胞分组

设立四组细胞加力，A组：对照组；B组：mTORC1信号通路抑制组；C组：Kae处理组；D组：Kae处理后抑制mTORC1信号通路组。加力前，C组和D组加入10μmol/LKae,A组和B组在加力前加入等体积DMSO；加力后，B组和D组立即加入mTOR信号抑制剂pp242(100nnol/L),A组和C组加入等体积PBS,4h后进行后续检测。

1.2.4化学比色法检测ALP活性

胰酶消化收集细胞后，与3mL带血清培养基混匀，离心清洗后反复冻融3次，离心后收集上清液50μL加入试剂盒中基质液和缓冲液各500μL,37℃水浴15min后加入显色剂1.5mL，立即检测其520nm波长下吸光度值，根据公式（y=1000x/17.9）计算出ALP活性。

1.2.5ELISA法检测OCN含量

将加力单元内培养液1mL离心后收集上清，在酶标包被板中入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL，混匀后37℃温育30min，弃液洗板甩干，加入工作液50μL,37℃温育30min后弃液洗板甩干后再加入显色剂50μL混匀，37℃避光显色15min后加终止液50μL终止反应后检测其450nm波长下吸光度值，通过标准品测量后的标准曲线的直线回归方程（y=3.732x+0.929）方程计算出培养液内骨钙素相对浓度。

1.2.6流式细胞仪检测细胞内钙离子相对含量

收集洗涤细胞后加入Fluo-4,AM工作液至终浓度为5μmol/L，置于细胞培养箱孵育30min，去除Fluo-4,AM工作液，用PBS洗涤细胞后重悬细胞，制成1×105个/mL的溶液再置于细胞培养箱孵育10min后立即在流式细胞仪下进行荧光钙离子检测（激发波长506nm，发射波长526nm），获得细胞内钙离子的相对含量（平均荧光强度）。

1.2.7WesternBlot检测mTORC1信号通路主要分子及成骨转录因子

收集硅胶膜上的细胞裂解后得到总蛋白，以牛血清为标准品，利用BCA蛋白定量试剂盒建立标准曲线，计算总蛋白浓度，取总蛋白20μg行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，脱脂奶粉封闭后一抗孵育过夜后二抗37℃孵育1h，置于自动成像仪暗匣中加显影液，计算机扫描收集图像，检测GAPDH、p-mTOR、p-S6K、4E/BP1、Osterix、Runx2蛋白表达水平，GAPDH作为内参。

1.2.8qRT-PCR检测mTORC1信号通路主要分子及成骨转录因子mRNA水平

收集硅胶膜上的细胞按Trizol试剂盒流程提取细胞中总RNA，通过异丙醇沉淀法浓缩RNA，进一步对总RNA行过柱纯化。qRT-PCR测定mTORC1信号通路及成骨转录因子mRNA，以GAPDH为内参。采用反转录试剂盒在BioRad1000TM上反转录成cDNA。再以第一链cDNA为模板，采用SYBRGreenI染料进行qRT-PCR反应。PCR扩增条件为：95℃30s;95℃5s,57℃30s，共40个循环。

1.3统计学方法

实验数据采用±s表示，使用SPSS13.0软件进行数据分析。组间比较使用采用单因素方差分析检验，P<0.05为差异有统计学意义。

表1引物序列

2、结果

2.1通过MTT试验、细胞计数、茜素红染色筛选出10μmol/LKae

通过MTT细胞试验发现牵张结束后4h，浓度为1、5、10、50、100μmol/L的Kae对应的细胞抑制率（图2a）分别为（3.11±0.88）%、（6.87%±1.40）%、（10.17±1.34）%、（26.63±5.46）%和（42.61±5.44）%，除5μmol/L与10μmol/L的组间差异无统计学意义（P=0.073）；其余各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）。

牵张结束后1、4、8h，可以发现浓度为50、100μmol/L的Kae组细胞增殖能力（图2b）明显受到抑制，而浓度为1、5、10μmol/L的Kae组细胞增殖能力基本一致。

图2加入不同浓度Kae进行细胞加力后4h细胞抑制率和细胞计数

牵张结束后7d发现10μmol/L的Kae组茜素红染色（图3）最为明显，5μmol/L的Kae组染色其次，其余各组染色不明显。

图3加入不同浓度Kae牵张后7d茜素红染色结果

2.2牵张后4h4组ALP、OCN、细胞内钙离子相对含量表达

牵张后4hA组、B组、C组、D组ALP分别为：（82.56±7.61)U/mg、（65.78±14.51)U/mg、（153.04±18.72)U/mg、（88.73±9.09)U/mg，除A组与D组间差异无统计学意义（P=0.359），其余各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）（图4a）。

A组、B组、C组、D组OCN表达分别为（0.78±0.15)U、（0.54±0.10)U、（1.64±0.25)U、（0.99±0.07)U，各组间差异均具有统计学意义（P<0.05）（图4b）。

牵张结束后A组、B组、C组、D组细胞内钙离子相对含量为96.63±5.97、94.23±4.61、78.23±5.08、90.84±4.33，除A组与B组（P=0.35）、B组与D组（P=0.189）间差异无统计学意义，其余各组间差异具有统计学意义（P<0.05）（图4c）。

图4牵张后4h4组ALP、OCN及细胞内钙离子相对含量表达

2.3牵张后4hmTORC1通路主要分子及成骨转录因子表达变化

2.3.1qRT-PCR结果

与对照组A组相比：B组mTOR、S6KmRNA水平明显受到抑制，4E/BP1mRNA水平无明显变化，Runx2及OsterixmRNA水平明显下调；C组mTOR、S6KmRNA水平均上调，4E/BP1mRNA水平下调，Runx2及OsterixmRNA水平上调。与C组相比：D组中被Kae上调的mTOR、S6KmRNA、Runx2及OsterixmRNA水平被pp242明显抑制，被Kae下调的4E/BP1mRNA水平被pp242明显上调（图5a～e）。

2.3.2WesternBlot结果

除B组Runx2蛋白表达与A组无明显差别外，各组p-mTOR蛋白、p-S6K蛋白、p-4E/BP1蛋白、Osterix蛋白、Runx2蛋白表达呈现与其mRNA表达水平一致的变化趋势（图5f）。

3、讨论

Kae是一种最先从姜科植物山奈中分离得到的黄酮醇类化合物，其大量存在于水果、蔬菜、豆类和茶叶及中草药如沙棘、银杏叶中。研究发现其具有广泛的成骨活性。Kae能够在体外实验中促进成骨细胞增殖和分化，提高成骨细胞内ALP活性[4,5]，这种促进ALP活性是通过细胞外调节激酶和雌激素受体途径来实现[6,7]。在卵巢切除动物模型中也发现Kae通过促进成骨细胞生成，抑制骨髓脂肪细胞的形成[8,9]。本实验通过MTT细胞毒性试验发现随着Kae浓度的逐渐增高，细胞抑制率逐渐上升，细胞增殖能力下降。而茜素红染色提示在Kae浓度为10μmol/L条件下的成骨效果最佳，说明在10%形变量的牵张力下10μmol/L的Kae能够最有效促进成骨效果，且细胞增殖能力未受到明显抑制。

图5牵张后4hmTORC1通路主要分子及成骨转录因子mRNA和蛋白表达情况

mTOR是一种保守的丝/苏氨酸蛋白质激酶，在细胞多种生理活动的调控中处于核心地位，其中研究较多的mTORC1由mTOR、Raptor和mLST8组成，能接受生长因子、应激等刺激并对雷帕霉素（rapamycin）敏感[10,11]。S6K和4E/BP1是mTORC1发挥其功能的主要下游效应分子。研究发现激活mTORC1信号促进S6K磷酸化，但抑制4E/BP1磷酸化[12]。本研究加入pp242后，mTOR和下游S6K的mRNA水平及磷酸化蛋白表达均受到抑制，而4E/BP1表达没有受到明显影响，说明mTROC1信号通路受到抑制。

Runx2是成骨细胞分化过程中的重要转录因子，是激活和促进骨髓间充质细胞向成骨细胞分化调节及促进成骨细胞成熟的关键。Osterix是一种成骨特异性因子，只在发育的骨组织中特异性表达。Chiou等[13]发现Kae能够显著促进MC3T3-E1成骨细胞ALP活性，上调骨钙素、骨桥蛋白和Ⅰ型胶原mRNA表达，诱导骨结节形成，而这种成骨作用与其增加Runx2的核移位有关。Kim等[14]也在MC3T3-E1成骨细胞中发现Kae通过激活Runx2和Osterix基因表达促进成骨。本研究中，C组（Kae处理组）结果提示，Kae能够有效促进ALP、OCN的蛋白表达以及成骨转录因子Runx2和Osterix的基因及蛋白表达，与以上研究结果一致。而且，在加入mTOR抑制剂pp242[11]后，mTORC1信号通路主要分子mTOR及S6K的基因表达及蛋白磷酸化水平均被抑制，另外ALP、OCN、Runx2和Osterix的表达也明显受到抑制，提示Kae通过mTORC1信号通路促进张应力下细胞成骨分化，而且Runx2、Osterix两种骨特异性转录因子可能处于mTOR信号通路下游。

Kae是一种线粒体钙离子单通道激活剂，能够降低心肌细胞线粒体钙离子[15]。在细胞自噬实验中发现，mTOR信号被抑制后，内质网-线粒体钙离子转运能力明显被抑制[16]。本研究中，Kae处理后mTROC1信号通路被激活，而且细胞内钙离子浓度明显下降，但当内源性mTOR信号被抑制后这种钙外流现象被消弱，提示Kae通过mTOR通路加速细胞内钙离子的外流释放从而促进细胞外基质钙化是其促进张应力下细胞成骨分化的机制之一。

本研究结果提示，Kae提高了牵张力下BMMCs成骨活性，增加Runx2和Osterix以及mTOR通路下游调节因子p-4E/BP1和p-S6K的表达水平，而pp242干预则逆转了Kae对骨形成的积极促进作用。本研究表明，Kae通过mTORC1信号通路促进单轴牵张力作用下的小鼠BMMCs成骨分化过程。

参考文献：

[3]彭海艳,蒋校文,黄华庆,等.mTORC1信号通路在张应力下小鼠骨髓间充质细胞成骨分化过程中的作用[J].口腔疾病防治,2020,28(4):219-223.

崔琳娜,蒋校文,黄华庆,陈金勇.山奈酚通过mTORC1信号促进牵张力下小鼠骨髓间充质细胞成骨分化机制研究[J].口腔疾病防治,2021,29(04):234-240.

基金:国家自然基金(81301651);湖南省自然科学基金(2018JJ2015);郴州市第一人民医院重点项目(N2019-003)