急性肺损伤(acute lung injury, ALI)及其严重形式急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是以急性发作、难治性低氧血症、肺水肿及上皮损伤为特征的非心源性呼吸衰竭[1],其常见病理改变以弥漫性炎性损伤、呼吸膜和血管等组织结构破坏为主[2]。目前ALI/ARDS的临床治疗主要以机械通气为主，缺乏特异的药物治疗[3],病死率仍高达35%～46%[1],是亟待解决的医学难题之一。清肺排毒汤对ALI展示了良好的防治效果，但其机制尚未明确。本研究通过观察清肺排毒汤对脂多糖诱导的ALI小鼠的影响，探讨其对ALI的作用机制。

1、材料和方法

1.1实验材料

药物及试剂：清肺排毒汤(处方：炙甘草、黄芩、枳实、细辛、陈皮6 g,麻黄、杏仁、桂枝、泽泻、猪苓、白术、姜半夏、生姜、紫苑、冬花、射干、藿香9 g,山药12 g,茯苓15 g,柴胡16 g,生石膏15～30 g,先煎)中药饮片购于上市药品零售企业老百姓大药房(药物浸泡30 min后，加水没过药面5 cm,武火煎至沸腾后改文火，继续煎煮20 min,取汁另置；继续加水，煎煮沸腾后，文火续煎20 min,取汁；两次药汁合并后浓縮至每毫升含生药2 g,并用离心机去除药汁中残渣，4℃保存备用)。脂多糖(北京索莱宝科技有限公司，Lot.No.111C031,L8880);苏木素染液(北京中衫金桥生物技术有限公司，19120302,ZLI-9610);伊红染色液(北京索莱宝科技有限公司，G1100);小鼠白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)试剂盒(江苏酶免实业有限公司，MM-0040M2);小鼠肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒(江苏酶免实业有限公司，MM-0132M2);小鼠IL-10试剂盒(江苏酶免实业有限公司，MM-0176M2);超净高级封片胶(珠海贝索生物技术有限公司，YZB,C210703);Scott蓝化液(北京索莱宝科技有限公司，G1865);Trizon Reagent(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0580S);超纯RNA提取试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，CW0581M);HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(诺唯赞生物科技股份有限公司，R223-01);ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞生物科技股份有限公司，Q711-02)。

主要仪器：全自动样品快速研磨仪(上海净信实业发展有限公司，Tiss-12);高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，H1750R);旋涡混合器(常州越新仪器制造有限公司，XH-C);全自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司，WD-2102B,);冷藏冷冻箱(美的，BD/BC-415DKEM);电热恒温培养箱(山东博科生物产业有限公司，DHP-9054);切片机(德国莱卡仪器有限公司，RM2235);电热鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司，HGZF-101-1);-80℃冰箱(山东博科生物产业有限公司，BDF-86V348);显微镜(奥林巴斯株式会社OLYMPUS,BX43)。紫外分光光度仪(NanoPhotometer, NP80);电泳仪(北京六一生物科技有限公司，DYY-8C);普通PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司，TC-EA);荧光PCR仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司，CFX ConnectTM实时);超高灵敏度化学发光成像系统仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司，Chemi DocTM XRS+)。

1.2实验动物及分组

C57BL/6小鼠30只，雄性，6～8周龄，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。饲养条件：温度20～26℃,湿度40%～70%,SPF级繁殖饲料，灭菌饮用水。

适应性饲养7 d后，随机分为空白对照组、模型组和治疗组，每组10只。

1.3模型制备

动物适应性饲养7 d后，除空白对照组外，其余小鼠参考文献[4]采用气道滴注脂多糖制备ALI模型。方法：异戊巴比妥钠(10 mg/kg)麻醉小鼠，将小鼠四肢被固定于泡沫板上，颈部切开，暴露气管；用1 mL注射器经气管壁插入气管内，将脂多糖(5 mg/kg)快速滴注小鼠气管中；完成后将泡沫板倾斜60～70°,并静置5 min,防止脂多糖逆流(该模型前期已通过预实验进行验证，模型成功标准：肺组织病理切片HE染色显示中性粒细胞的浸润增多，肺泡壁增厚，红细胞大量渗出；肺组织中炎性因子的表达增加)。空白对照组气道滴注等量的生理盐水。

1.4给药方法

造模2 h后，空白对照组、模型组给予生理盐水0.3 mL灌胃，间隔4 h,连续3次；治疗组给予清肺排毒汤0.3 mL灌胃治疗，间隔4 h,连续给药3次。

1.5观察指标

一般体征观察：观察各组小鼠一般情况变化，包括毛发光泽、精神状态、呼吸、食欲、活动情况等。

肺组织HE染色：末次给药12 h后处死小鼠，取小鼠肺组织流水冲洗数小时，经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，纯酒精、二甲苯等量混合液15 min,二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min(至透明为止)。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15 min,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、透蜡各50～60 min。石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3 min,盐酸乙醇分化液分化15 s,稍水洗，返蓝液返蓝15 s,流水冲洗，伊红染色3 min,流水冲洗，脱水，透明，封片，镜检。

肺湿干质量比值测定：用滤纸小心擦拭肺组织表面水分后置于分析天平测定肺湿质量，于80℃烤箱内烘烤。2 d后，取出干燥的肺组织再次测定肺干质量，计算湿/干质量(wet/dry mass, W/D)比值。

ELISA检测IL-1β、IL-10、TNF-α的含量：取小鼠肺泡灌洗液，使用双抗体夹心法检测IL-10、IL-1β和TNF-α的表达，根据试剂盒说明操作。

定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)检测：收集各组组织样品，取50 mg样品剪碎、裂解并充分研磨。根据试剂盒说明提取各实验组小鼠肺组织RNA,并测定RNA的浓度和纯度，以及RNA的完整性。当确认提取的RNA质量完好时可参考诺唯赞的RNA逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA,在荧光定量PCR仪上进行检测，以β-actin为内参，计算出各组NLPR3基因的相对表达量。引物设计如下：

β-actin F:5′-AGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,β-actin R:5′-CATACCCAAGAAGGAAGGCT-3′,192 bp,退火温度58.2℃;

NLRP3 F:5′-ACCTCAACAGTCGCTACACG-3′,NLRP3 R:5′-ATGGTTTTCCCGATGCC-3′,214 bp,退火温度58.6℃。

操作体系(20μL反应体系):2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL,cDNA 1μL,上、下游引物各0.4μL,RNase Free ddH20 8.2μL。

反应程序，三步法：预变性95℃,10 min, 1个循环；变性95℃,10 s, 40个循环；退火58℃,30 s, 40个循环；延伸72℃,30 s, 40个循环。

1.6统计学方法

应用SPSS 20.0进行统计分析。定量结果采用均数±标准差表示。两组之间比较采用独立样本t检验，多组之间定量比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，检验水准α=0.05。

2、结 果

2.1一般体征观察

经适应性喂养1周后，各组小鼠一般情况良好。空白对照组小鼠毛色有光泽，精神好，活动频繁，食欲正常，无扎堆情况。造模后，除空白对照组外，各组小鼠逐渐出现呼吸异常、喘促，没精神，身体发颤，食欲不佳，扎堆聚集等现象。模型组与治疗组均有一只小鼠死亡。经清肺排毒汤灌胃治疗12 h后(模型组生理盐水灌胃),模型组除身体发颤减轻，其余情况无改善；治疗组小鼠一般情况有所改善。主要表现在喘促有所减轻，但仍然食欲不佳，没精神，喜好扎堆。空白对照组小鼠无上述情况。

2.2各组小鼠病理组织结构变化

模型组小鼠经清肺排毒汤处理后，HE染色观察不同组别小鼠的组织病理学变化。见图1:空白对照组小鼠肺组织结构正常，肺泡间隔厚度正常，未见明显的炎性浸润。模型组小鼠肺组织结构发生破坏，肺泡间隔明显变宽，肺泡萎缩，肺泡壁水肿充血，伴有大量炎性浸润。相比于模型组，药物处理后肺组织破坏程度减轻，肺泡间隔厚度变小，充血水肿有所缓解，炎性浸润现象减少。

图1各组小鼠肺组织病理结构比较(HE,100×)  

2.3肺湿干质量比值

空白对照组、模型组和治疗组的W/D分别为3.92±0.86、7.23±0.35和4.92±0.53。与正常组相比，模型组肺组织W/D明显增高(P<0.05),表明模型组出现明显肺水肿。而与模型组相比，治疗组肺组织W/D明显降低(P<0.05)。表明清肺排毒汤可减轻ALI过程中发生的肺水肿。

2.4小鼠肺组织炎症相关因子的表达水平

如图2所示，与对照组相比，模型组的IL-1β和TNF-α的表达均显著上调。IL-1β和TNF-α作为炎症反应的关键细胞因子，其表达量越高，表明ALI程度越严重。此外，抑炎因子IL-10在模型组的低表达亦证明了这点。与模型组相比，治疗组IL-1β和TNF-α的表达显著下调，IL-10显著上调(P<0.05)(见表1),清肺排毒汤可影响脂多糖诱导的ALI炎症相关因子的表达。

表1各组小鼠炎症因子表达水平比较(x¯±s,ng/L)

图2各组小鼠炎症因子表达水平比较 

2.5小鼠肺组织NLRP3炎性小体表达

研究表明NLPR3炎性小体信号通路在ALI发展过程中起着关键性作用。本实验通过qPCR检测不同实验组NLPR3的表达情况，结果见图3:与空白对照组相比，NLPR3在模型组中高表达，与模型组相比，治疗组NLPR3的表达显著下调(P<0.05),说明NLPR3可能参与脂多糖诱导的ALI,清肺排毒汤可以减轻过度激活NLPR3导致的肺损伤。

图3 NLPR3在体外ALI模型中的表达水平 

与对照相比,*P<0.05;与模型组相比,#P<0.05

3、讨 论

ALI中医虽无病名的记载，但ALI临床表现为喘、满、昏、热，其中尤以喘、满表现更甚，多数医家将其归属于中医学“暴喘”范畴，包括“喘促证”和“喘脱证”[5]。ALI病位主要在肺和肾，肺为气之主，肺主气，司呼吸，开窍于鼻，外合皮毛，且肺为娇脏，不耐寒热，若外邪侵袭，可使肺失宣降，呼吸不利肺气上逆而致喘促。肺失宣降，通调水道功能失常，不能“水津四布”,聚而为痰，壅滞于肺，故见喘息不得平卧。肾主纳气，肾元不固，摄纳失常，则气不归元，亦可气逆而喘。晚期气阴亏耗，阴损及阳，阳微欲绝可导致喘脱之证。ALI病机虚实夹杂，关键在于瘀、热、水、虚四方面[6]。ALI中医治法主要有：通里攻下法、益气活血化瘀法、肺肠同治法、清热解毒法、扶正祛邪法、清热化痰法等。中医药通过整体调节机体的阴阳平衡，结合辨证施治的个体化治疗，对ALI的防治发挥了独特的作用。加强中医药治疗的实验研究，对揭示中医药的作用机制，开发具有我国自主知识产权的治疗药物，有着十分重要的理论、经济和社会意义。

研究表明，ALI早期的炎症级联放大是启动和加速疾病进展的关键节点[7,8]。NLRP3炎性小体是近年来炎症研究领域的热点之一，是胞内参与多种炎症反应的重要模式识别受体，为启动并放大炎症反应的感受装置，可识别多种病原相关分子，活化炎性凋亡蛋白酶——胱天蛋白酶，促进IL-1β、IL-18等炎症因子的成熟与分泌[9]。NLRP3炎性小体在肺部表达丰度高[10],与肺部疾病的发生、发展关系密切[11]。

新冠肺炎患者存在不同程度的肺损伤，造成相应的呼吸道症状。短时间内发生的细胞因子风暴对患者的肺组织造成了严重的病理损伤，细胞因子风暴的强弱与疾病的严重程度相关[12]。清肺排毒汤组方源自中医古籍《伤寒杂病论》,主要由麻黄、炙甘草、杏仁和生石膏等21味中药组成，涉及麻杏石甘汤、五苓散、小柴胡汤及射干麻黄汤4个经方[13]。此方中麻杏石甘汤辛凉宣泄、清肺平喘。麻黄与石膏相伍，一寒一热，既辛散在经表之寒邪，又清泄肺中之热。而麻黄与苦杏仁相伍，一宣一降，可调畅肺之气机，宣肺平喘；五苓散甘淡渗利为主辅以桂枝通三焦水道之阳气，温阳化气以助利水，解表散邪以祛表邪，使热从小便出；小柴胡汤解表散热，和解少阳，运转枢机、调理三焦，助肺脾行散寒湿疫毒；射干麻黄汤可温肺散寒、化饮涤痰，细辛、半夏、生姜主以宣散中焦之湿，兼散肺内水饮。紫菀、款冬花、射干则可泻肺豁痰化饮，制肺内之寒湿。4首方剂合用，共奏解表宣肺、祛痰平喘之功，能有效缓解ALI患者的发热、胸闷、咳喘等症状。另外，藿香芳香化浊，与茯苓、白术、山药、陈皮四味药健脾除湿药共达培土生金之功，解决腹胀、腹泻等胃肠不适的症状。回顾性分析研究[14]显示，清肺排毒汤可改善肺损伤患者临床症状、中医证候，促进核酸转阴，减少住院天数、不良反应发生率。新冠肺炎病程进展快，ALI明显。清肺排毒汤在临床上能够获得良好疗效，可能与其能够减轻早期炎症级联放大反应、影响相关炎性因子的表达、减弱细胞因子风暴有关。有学者利用网络药理学和分子对接技术预测了清肺排毒汤治疗新冠肺炎的潜在作用机制。认为其主要通过槲皮素、木犀草素、山柰酚等主要成分，作用于IL、TNF、丝裂原活化蛋白激酶等关键分子，影响Toll样受体通路、IL信号通路、TNF信号通路等途径，进而发挥免疫调节、抗感染、抑制炎症风暴等作用[15]。在抗病毒药效方面，王琨等[16]通过体外实验从多个角度证明清肺排毒汤具有较好的体外抗冠状病毒活性，主要作用于病毒感染的早期阶段。

本研究结果表明，清肺排毒汤能明显改善ALI模型小鼠一般情况及组织病理变化，明显减轻肺水肿症状，对脂多糖诱导的ALI模型小鼠有明显的治疗作用，显著下调NLPR3的表达，能明显下调致炎因子IL-1β和TNF-α的表达，并增加抑炎因子IL-10的表达。这提示清肺排毒汤可减轻NLPR3的过度激活，可影响下游炎症因子的表达，抑制细胞因子风暴，从而改善ALI炎症反应。

综上表明，清肺排毒汤对脂多糖诱导的ALI模型小鼠有明显的治疗作用，其机制可能与抑制NLPR3炎性信号通路，调节相关炎性因子的表达，抑制细胞因子风暴有关。

参考文献:

[3]任正肖,车萍,李紫薇,等.NLRP3炎性体与2019冠状病毒病(COVID-19)肺损伤的研究进展[J].细胞与分子免疫学杂志,2021,37(9):844-850.

[4]顾玮,张丽,刘国权.气道滴注与腹腔注射脂多糖建立小鼠急性肺损伤模型的效果比较[U].山西医科大学学报,2020,51(11):1206-1210.

[5]苏景深,刘恩顺,赵鑫民.急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征中医药治疗研究进展[J.吉林中医药,2019,39(5):696-700.

[6]陈岩,白雪松,隋吉峰,等.聚类分析研究急性呼吸窘迫综合征证候规律[J.辽宁中医药大学学报,2013,15(11):13-14

[12]姜慧欣,黄学涵,林果,等.纽胞因子风暴在2019新型冠状病毒肺炎肺损伤中的作用[J.临床与病理杂志,2022,42(2).462-471.

[13]佟琳,马艳,范逸品,等.基于文献的清肺排毒汤组方治疫应用规律探讨[J].中医杂志,2021,62(21):1877-1881.

[14]孙易娜,吕文亮,李昊,等.清肺排毒汤治疗轻型/普通型新型冠状病毒肺炎295例多中心临床研究[].中医杂志,2021,62(7)599-603.

[15]刘斌,龚照元,李慧珍,等.清肺排毒汤治疗新型冠状病毒肺炎的文献研究[J].中医杂志,2021,62(21):1882-1889.

基金资助:湖南中医药高等专科学校新冠肺炎研究专项(3);

文章来源:邱爱珠,徐晔青,欧阳翌国等.清肺排毒汤对脂多糖诱导急性肺损伤模型小鼠的作用及机制[J].吉林医药学院学报,2023,44(04):