系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种累及多系统、多器官的自身免疫性疾病，以产生大量针对细胞核成分的自身抗体及循环免疫复合物为特征[1]。近年来研究表明B细胞的异常活化及浆细胞的异常分化在SLE的发病中起着至关重要的作用[2]。BET蛋白（包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT 4个亚型）是组蛋白乙酰化标记的识别器，对基因转录具有重要的调控作用[3]。近年越来越多的研究显示BET蛋白参与调节免疫和炎症反应[4];BET蛋白抑制剂通过特定基因启动子区域的染色质重排，参与调节T细胞、巨噬细胞等免疫细胞介导的免疫炎症反应[5]。但BET蛋白是否通过调控SLE发病环节中的关键细胞B细胞，从而参与SLE的发病目前仍不清楚。据此，本研究将利用MRL/lpr狼疮小鼠模型，研究BET蛋白特异性抑制剂JQ1对狼疮小鼠B细胞亚群分化的影响及其治疗作用。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

雌性MRL/lpr小鼠（SPF级），12周龄，购于上海斯莱克实验动物有限公司。动物饲养在中山大学实验动物中心SPF级动物房。本研究获得中山大学附属第一医院医学伦理委员会审核批准[伦审（2018)189号]。动物实验过程中遵循各项动物伦理要求，注重保障动物福利。

1.1.2试剂

JQ1购于美国Selleck公司；DMSO、RPMI1640培养基购于美国Sigma公司；尿蛋白定量测定试剂盒、血清肌酐检测试剂盒、血清尿素氮测定试剂盒均购于南京建成；血清补体C3、C4、ANA、抗ds-DNA抗体及免疫球蛋白测定试剂盒购于武汉华美生物；FITC标记兔抗小鼠IgG单克隆抗、FITC标记羊抗小鼠C3单克隆抗体均购于英国Abcam公司；胎牛血清购于美国Gibco公司；Ficoll-Paque购于美国GE公司；BD IMagTM buffer、Biotinylated Mouse B Lymphocyte Enrichment Cocktail、BD IMagTM Streptavi‐din Particles Plus-DM均购于美国BD公司；LPS购于法国InvivoGen公司；rIL-4购于美国PeproTech公司；逆转录试剂盒、SYBR荧光定量PCR试剂盒均购于日本TaKaRa公司；流式抗体购于美国Biolegend公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成，所有引物序列见表1。

1.2方法

1.2.1小鼠分组及处理

将MRL/lpr小鼠随机分为2组，分别为模型对照组（DMSO组）15只小鼠、JQ1治疗组12只小鼠。从12周龄开始JQ1治疗组腹腔注射JQ1 50 mg/（kg·d)[6]，模型对照组每天腹腔注射10%DMSO，治疗时间持续6周。

1.2.2测定24 h尿蛋白定量（CBB法）

每2周使用代谢笼留取MRL/lpr小鼠24 h尿，采用CBB法测定尿蛋白，采用酶标仪于波长596 nm测吸光度值。

1.2.3测定血清BUN、Cr定量

按照肌酐检测试剂盒、尿素氮测定试剂盒说明书测定血清BUN、Cr含量。

1.2.4 ELISA法

利用ELISA法检测血清补体C3、C4、ANA、抗ds-DNA抗体及免疫球蛋白水平，按照ELISA说明书进行。

1.2.5 PAS染色及免疫荧光染色

水化4μm厚切片，0.5%高碘酸氧化切片5 min，流动水持续冲洗2 min，双蒸水浸泡，加入无色品红于室温避光孵育15 min，滴洗0.5%偏重亚硫酸钠孵育，Mayer苏木素染核2 min，流动水冲洗10 min，脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。4μm厚冰冻切片组织，室温PBS水化10 min，用5%山羊血清室温封闭30 min，加入1∶200稀释的FITC标记兔抗小鼠IgG单克隆抗体或FITC标记羊抗小鼠C3单克隆抗体50μl,37℃水浴，避光条件下孵育30 min,PBS洗涤，甩干后封片。

1.2.6肾脏病理损害评分

肾小球病理损害程度评估，按0～3分半定量计分方法[7]，每只小鼠标本至少评价40个连续非重叠的肾小球（×400），采用盲法评分，最终评分以表示；肾血管病理损害程度评估，按0～3分半定量计分方法[8]，每个标本的所有血管进行评估，采用盲法评分，最终评分以xˉ±s表示。

表1引物序列 

1.2.7单个核细胞悬液的制备

1.2.7. 1小鼠淋巴结或脾脏单个细胞悬液的制备

摘取肠系膜淋巴结或脾脏置于培养皿中，仔细研磨淋巴结或脾脏，用预冷的PBS冲洗并将全部液体收集于15 ml离心管中，4 000 r/min离心5 min，弃上清，保留沉淀，用含10%FBS的RPMI1640培养基重悬细胞。

1.2.7. 2小鼠外周血单个核细胞的制备

取小鼠外周血1 ml，采取密度梯度离心（Ficoll-Paque）法分离外周血单个核细胞，收集白色窄带层于离心管中，PBS洗涤2次，用RMPI1640培养基将细胞重悬并定容。

1.2.8小鼠脾脏B淋巴细胞磁珠分选纯化

使用BD IMagTM buffer重悬细胞，加入Biotinylated Mouse B Lymphocyte Enrichment Cocktail，室温孵育15 min，用10倍体积的BDIMagTMbuffer洗涤，加入BD IMagTM Streptavidin Particles Plus-DM，室温孵育30 min，过磁力架6～8 min，吸取上清，放入新的流式管，重复上述步骤2次得到上清液，经流式细胞仪检测B细胞纯度>95%，用于后续实验。

1.2.9小鼠脾脏B细胞体外培养

将纯化的小鼠脾脏B细胞以含10%FBS的RPMI1640培养基重悬（1×106个/ml），接种于48孔平底细胞培养板，加入LPS (10μg/ml),rIL-4 (10 ng/ml），体外培养72 h后用于后续实验。

1.2.10小鼠脾脏B细胞prdm1 mRNA检测

1.2.10. 1 RNA提取与逆转录

将B细胞悬液收集入无RNA酶、无菌的1.5 ml EP管中，离心后保留沉淀。Trizol法提取细胞总RNA，核酸定量仪测定RNA的浓度与质量。依照逆转录试剂盒说明书配制逆转录体系，将RNA逆转录为cDNA，将cDNA用灭菌ddH2O稀释至合适倍数，-80℃保存。

1.2.10. 2 RT-qPCR方法检测prdm1表达

采用TaKaRa公司的SYBR荧光定量PCR试剂盒，参照说明书配制反应体。采用三步法进行PCR反应，将靶基因出峰的循环数（Ct值）与内参基因（β-actin）进行比较，计算各目的基因的相对表达水平。

1.2.11流式细胞术表面分子染色

收集单细胞悬液，PBS洗涤，按1∶200稀释流式抗体，每个样品加入0.5μl流式抗体，于4℃避光孵育30 min，终止染色，500μl PBS重悬细胞，流式细胞仪进行检测。

1.3统计学分析

所得数据用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料用表示，多组数据间差异比较采用方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 JQ1对MRL/lpr小鼠蛋白尿的影响

MRL/lpr小鼠经治疗4周后，与DMSO组相比，JQ1治疗组24 h尿蛋白定量均有减少，经治疗6周后，JQ1治疗组与DMSO组相比，24 h尿蛋白定量明显减少（图1）。

2.2 JQ1对MRL/lpr小鼠肾功能的影响

MRL/lpr小鼠经治疗6周后，与DMSO组相比，JQ1治疗组血清BUN及Cr水平均显著降低（P<0.05，图2）。

2.3 JQ1对MRL/lpr小鼠血清补体C3、C4、ANA及抗ds-DNA抗体的影响

MRL/lpr小鼠治疗6周后，经ELISA检测血清补体C3、补体C4、ANA及抗dsDNA抗体水平发现，JQ1治疗组补体C3、C4水平均明显高于DMSO组，而ANA及抗ds-DNA抗体水平均显著降低（图3）。

2.4 JQ1对MRL/lpr小鼠血清免疫球蛋白水平的影响

MRL/lpr小鼠治疗6周后，ELISA检测血清IgG、IgG1、IgG2a、IgM水平发现，与DMSO组相比，JQ1治疗组血清IgG、IgG1、IgG2a、IgM水平均显著降低（图4）。

2.5 JQ1对MRL/lpr小鼠肾脏组织病理学的影响

MRL/lpr小鼠肾脏组织PAS染色后，观察肾小球细胞增殖和（或）细胞浸润及肾血管病理损害程度并对其评分发现，与DMSO组对比，JQ1治疗组肾小球、肾血管的病理损害程度均明显减轻，肾小球、肾血管病理学评分均显著低于DMSO组（图5）。

图1 JQ1对MRL/lpr小鼠24 h蛋白尿的影响 

图2 JQ1对MRL/lpr小鼠肾功能的影响 

图3 JQ1对MRL/lpr小鼠血清补体C3、C4、ANA、anti-ds-DNA抗体的影响  

图4 JQ1对MRL/lpr小鼠血清免疫球蛋白水平的影响  

图5 JQ1对MRL/lpr小鼠肾脏组织病理学的影响 

2.6 JQ1对MRL/lpr小鼠肾脏IgG和C3沉积的影响

MRL/lpr小鼠肾脏组织免疫荧光染色后，观察肾脏组织中IgG和C3的沉积情况发现，DMSO组肾脏组织中可见大量的呈颗粒状IgG和C3沉积于肾小球毛细血管壁、系膜区，而JQ1治疗组肾脏IgG和C3的沉积显著减少（图6）。

2.7 JQ1对MRL/lpr小鼠体内B细胞各亚群分化的影响

如图7所示，分离各组小鼠的脾脏（spleen,SP）、淋巴结（lymph node,LN）、外周血（peripheral blood,PB）组织中的单个核细胞，利用流式细胞术分析B细胞中各亚群细胞比例。结果表明，与DMSO组相比，JQ1治疗组小鼠体内各器官中CD19+CD138+浆细胞亚群的比例均明显减少，同时也显著降低B220+IgD-CD38+记忆B细胞亚群的比例。

图6 JQ1对MRL/lpr小鼠肾脏IgG和C3沉积的影响  

图7 JQ1对MRL/lpr小鼠体内B细胞各亚群分化的影响 

图8 JQ1对MRL/lpr小鼠体内B细胞prdm1 mRNA表达的影响  

2.8 JQ1对MRL/lpr小鼠B细胞prdm1 mRNA表达的影响

结果发现，与DMSO组相比，JQ1治疗组小鼠脾脏B细胞中prdm1 mRNA表达水平显著降低（图8），提示JQ1抑制MRL/lpr小鼠体内浆细胞分化可能与其抑制B细胞中Blimp1表达有关。

3、讨论

SLE是以多器官功能受损为特征的全身性自身免疫性疾病[1]。约50%以上的SLE患者有肾损害的临床表现，肾脏受累可出现血尿和（或）蛋白尿、水肿、高血压，伴或不伴肾功能受损，肾衰竭是SLE患者病死的常见原因。免疫复合物形成与沉积是引起SLE肾损害的主要机制[9]。

MRL/lpr小鼠最早由MURPHY和ROTHS建立于1979年[10,11,12,13]。MRL/lpr小鼠体内多种自身抗体的产生，循环免疫复合物的沉积，脾脏及淋巴结的肿大等一系列的表现，类似于人类SLE及狼疮性肾炎的表现，是目前研究SLE及LN最常见的自发性动物模型之一。

越来越多的研究显示BET蛋白可能参与调节免疫和炎症反应。研究显示，BRD2、BRD4与巨噬细胞中炎症细胞因子基因的启动子相结合，直接调控巨噬细胞炎症因子的表达和炎症反应，siRNA下调BET蛋白或小分子抑制剂JQ1以阻止BET蛋白与组蛋白相结合，可以抑制巨噬细胞的炎症反应[14]；更为重要的是，BET蛋白可以调节炎症和免疫性相关的肾损害。有研究发现，特异性BET蛋白抑制剂可以有效地下调肾细胞TNF-α介导或HIV感染介导的NF-κB信号通路的活化，进一步抑制NF-κB介导的炎症反应和肾损害[15];BET蛋白抑制剂可以有效改善病理性纤维化反应，延缓小鼠单侧输尿管结扎术后诱发肾纤维的疾病进展[16]。

为了进一步探讨抑制BET蛋白对SLE的治疗作用，本研究应用BET蛋白抑制剂JQ1治疗MRL/lpr狼疮小鼠模型。结果发现，腹腔注射BET抑制剂JQ1治疗后，MRL/lpr小鼠血清中致病性自身抗体和免疫球蛋白的分泌减少，补体C3、C4回升，肾小球系膜细胞增殖、基质增生、细胞浸润均明显减少，肾血管周围炎症细胞浸润也明显减少，肾脏损害减轻，循环免疫复合物形成与沉积显著减少。以上结果提示抑制BET对MRL/lpr狼疮小鼠有良好的治疗作用。上述结果与以前报道类似，但JQ1治疗狼疮小鼠的机制仍然不甚清楚[17]。

在人类LN和MRL/lpr小鼠中，大量活化的B细胞释放入外周组织，导致产生多种自身抗体和高球蛋白血症[18,19,20]。本研究也观察到，模型对照组狼疮小鼠血清中含有高滴度的抗ds-DNA抗体、ANA抗体，以及高水平的IgG、IgG1、IgG2a、IgM。其肾脏免疫荧光染色见大量呈颗粒状IgG和C3沉积于肾小球毛细血管壁、系膜区。而在JQ1治疗组中，抗ds-DNA抗体、ANA抗体滴度均显著降低，IgG、IgG1、IgG2a、IgM等免疫球蛋白水平显著下降，肾脏中IgG和C3的沉积显著减少，提示JQ1可显著减少狼疮小鼠自身抗体及免疫球蛋白的产生，而且其可能与调控产生自身抗体密切相关的浆细胞分化有关。

为了进一步证实BET蛋白抑制剂治疗狼疮小鼠的疗效是否与其调控其体内B细胞分化有关，观察了在JQ1治疗下MRL/lpr狼疮小鼠体内浆细胞和记忆性B细胞等亚群细胞比例的变化。结果发现，治疗6周后，JQ1不仅可以抑制浆细胞的分化，同时可以抑制记忆性B细胞的分化。结果提示BET蛋白抑制剂能明显抑制MRL/lpr小鼠体内浆细胞的分化，这可能是BET蛋白抑制剂发挥治疗作用的重要机制之一。还进一步发现，JQ1能显著抑制狼疮小鼠体内B细胞Blimp1表达，而Blimp1在浆细胞中高表达，而且是调控浆细胞分化的关键分子[21]，因此，这进一步提示JQ1很可能通过抑制Blimp1调节浆细胞分化，但其具体的机制有待进一步深入探讨。目前发现，BET蛋白具有广泛的免疫炎症调节功能，参与调控T细胞、树突状细胞、巨噬细胞以及内皮细胞等多种细胞的生物功能[22,23,24]。虽然结果提示BET蛋白抑制剂治疗SLE的主要机制可能是通过调控浆细胞分化，但仍不能除外BET蛋白抑制剂通过其他途径发挥治疗作用，这有待今后进一步的研究。

综上所述，本研究发现抑制BET蛋白可以有效抑制SLE小鼠体内B细胞分化，尤其是浆细胞的形成。提示BET蛋白可能是通过调控浆细胞分化，进而对SLE发挥治疗作用，BET蛋白是SLE治疗的一个潜在靶点，尤其可能给以长寿命浆细胞介导的难治性、复发性SLE的治疗提供新的思路。

参考文献:

[1]张清平,陈永旺.栀子苷通过抑制NLRP3炎症小体激活治疗MRLIpr小鼠狼疮性肾炎[J].中国免疫学杂志,2021,37(17):

基金资助:国家自然科学基金青年科学基金项目(81701611);广州市民生科技攻关计划项目(201803010042);

文章来源:曾珊,肖游君,邱茜等.BET蛋白抑制剂JQ1对MRL/lpr狼疮小鼠外周B细胞分化的影响[J].中国免疫学杂志,2023,39(07):1345-1350.