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基于能量代谢调控探究健脾益肾方抗顺铂诱导小鼠急性肾损伤机制

2023-07-24 90 上传者：管理员

摘要：探究健脾益肾方对顺铂诱导急性肾损伤小鼠的保护作用及机制。【方法】将12只8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、健脾益肾方干预组，每组4只。健脾益肾方干预组预先给予15.73 g•kg-1•d-1健脾益肾方灌胃6 d，第6天模型对照组和健脾益肾方干预组小鼠腹腔注射顺铂20 mg•kg-1诱导急性肾损伤，空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水。造模72 h后处死取材，检测血清肌酐及尿素氮含量，采用超高效液相色谱检测肾组织三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)的含量。【结果】(1)与空白对照组比较，模型对照组血清肌酐、尿素氮水平显著增高(P<0.01)；健脾益肾方干预组小鼠血清肌酐水平显著低于模型对照组(P<0.01)，尿素氮有下降趋势但差异没有统计学意义(P>0.05)。(2)模型对照组小鼠肾组织AMP含量及AMP/ATP比值较空白对照组显著降低(P<0.05或P<0.01)，健脾益肾方干预组小鼠肾组织AMP含量以及AMP/ATP比值显著高于模型对照组(P<0.05)，而ATP、ADP含量及ADP/ATP比值的3组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】健脾益肾方可有效抑制顺铂诱导小鼠急性肾损伤，对肾脏有保护作用，其机制可能与调控AMP、ATP能量代谢有关。

关键词：
健脾益肾方
小鼠
急性肾损伤
能量代谢
顺铂
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急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）是指短时间内肾功能急速下降的一组临床综合征，其发病率高、死亡率高、治疗成本高，有效治疗方案却很局限[1]。健脾益肾方是李顺民教授在国医大师邓铁涛教授五脏相关理论——肾病从脾论治、脾肾相关基础上，结合多年的临证经验，倡导两补五通治疗大法，即“补脾、补肾”“通大便，通小便，通汗液，通呼吸，通血脉”，总结出的经验方剂，可有效延缓慢性肾脏病（CKD）进展，改善临床症状，降低患者血清肌酐及尿素氮水平[2]。既往关于健脾益肾方的机制研究发现，该方可以改善肾小管萎缩和间质纤维化，降低肾脏细胞外基质沉积，抗炎，纠正贫血，调节代谢，纠正缺氧，抑制上皮间质转化，改善线粒体分裂/融合平衡功能及自噬，抗氧化应激，调节肠道菌群等[3,4,5,6,7,8]。肾脏是高耗能器官，但健脾益肾方在保护肾脏、抵抗AKI过程中肾损害的潜在代谢分子机制，对肾脏能量代谢稳态有何作用尚不清楚。三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）是体内能量储存和代谢的重要物质，是生物体内直接的能量来源，二磷酸腺苷（adenosine diphosphate,ADP）和单磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）是ATP的水解产物。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是细胞的能量感受器，可通过与ATP、ADP和AMP的直接相互作用感知细胞的能量变化[9]。通过检测肾脏组织ATP、ADP和AMP的浓度可以反映肾脏能量代谢水平的高低。因此，本研究建立AKI小鼠模型，检测小鼠肾脏组织ATP、ADP、AMP的浓度，探究健脾益肾方对AKI小鼠肾脏能量代谢的影响，以期为AKI的预防及治疗提供新思路，现将研究结果报道如下。

1、材料与方法

1.1实验动物

12只普通级8周龄雄性C57BL/6J小鼠，体质量20～25 g，购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-0002，饲养于深圳市中医院科教中心。所有动物实验均通过深圳市中医院伦理委员会审批（批号：K2022-096-01）。适应性喂养1周。标准饲养环境：温度（24±2）℃，湿度45%～55%,12 h/12 h白日黑夜交替，自由饮水和进食。

1.2仪器

QTRAP 5500质谱仪（美国Sciex公司）；Shimadzu LC-30AD超高效液相色谱系统（日本Shimadzu公司）；氮吹仪（瑞典Biotage公司）；5424 R冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）；Kinetex Biphenyl色谱柱（1.7μm,2.1 mm×100 mm，美国Phenomenex公司）；Milli-Q Integral 5超纯水一体化系统（德国Merck公司）；混匀仪（法国Bertin公司）。

1.3试剂

顺铂、乙酸铵、AMP、ATP、ADP标准品（美国Sigma公司）；亚甲基二磷酸（上海毕得医药科技股份有限公司）；乙腈、甲醇（德国Merck公司）；肌酐、尿素氮检测试剂盒（加拿大StressMarq公司）。

1.4药物及制备

健脾益肾方，由黄芪30 g、丹参15 g、山药30 g、生白术10 g、肉苁蓉10 g、白豆蔻10 g、生大黄10 g、炙甘草6 g等8味中药组成，以上中药材购自深圳华辉制药有限公司。将上述原材料置于超纯水中煮沸，过滤后用冷冻干燥剂干燥制成冻干粉并置于-80℃冰箱中储存。使用前将冻干粉用超纯水溶解。健脾益肾方冻干粉制备由深圳市中医院制剂室完成。

1.5动物分组、造模与给药

根据随机数字表将小鼠分为空白对照组、模型对照组和健脾益肾方干预组，每组4只。按照人与动物体表面积换算等效剂量法[10]确定给药剂量，健脾益肾方干预组预先给予健脾益肾方15.73 g·kg-1·d-1连续灌胃6 d。在给予健脾益肾方后的第6天，模型对照组和健脾益肾方干预组小鼠给予腹腔注射顺铂20 mg·kg-1诱导AKI模型[11]，空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水。顺铂诱导AKI可出现肾功能指标异常，如血清肌酐、尿素氮的快速增加，若模型对照组小鼠血肌酐、尿素氮较空白对照组明显上升，则判断顺铂诱导的AKI模型构建成功[11]。

造模72 h后处死取材，收集眼球血和肾组织。

1.6观察指标与方法

1.6.1血清肌酐、尿素氮检测

将小鼠眼球血室温静置1 h后，离心取血清，按照试剂盒说明书步骤操作，检测小鼠血清肌酐、尿素氮浓度。

1.6.2 UPLC-QQQ-MS/MS法检测小鼠肾组织AMP、ATP、ADP含量

1.6.2. 1液相色谱、质谱条件

Phenomenex KinetexBiphenyl色谱柱（1.7μm,2.1mm×100mm）。流动相A:10mmol/L乙酸铵-5μmol/L亚甲基二磷酸；流动相B:10 mmol/L乙酸铵的90%乙腈-5μmol/L亚甲基二磷酸。梯度洗脱程序见表1。柱温为40℃，流速为0.3 mL/min，进样体积为2μL。采用QTRAP 5500质谱仪在负离子模式下进行质谱分析。QTRAP 5500 ESI源条件如下：Source temperature,450℃；Ion Source Gas1(Gas1),45 Psi;Ion Source Gas2(Gas2),45 Psi;Curtain gas(CUR),30 Psi;ionSapary Voltage Floating(ISVF),-4 500 V。采用MRM模式检测待测离子对，AMP、ATP及ADP的离子对信息见表2。配制不同浓度的AMP、ATP、ADP标准品溶液，测定峰面积为Y轴，浓度为X轴，绘制成标准曲线。

1.6.2. 2代谢检测组织提取条件

精密称取小鼠肾皮质10 mg于匀浆管中，加入3颗研磨珠和300μL的80%低温甲醇水溶液，于4℃下70 Hz研磨2 min后置于-80℃冰箱保存12 h。将匀浆液于4℃离心机中以12 000 r/min离心20 min，取上清液至EP管中。剩余的沉淀物加入300μL的80%低温甲醇水溶液后再次研磨2 min，离心后将上清液与初次提取的上清液混合。取上清液100μL置于氮吹仪中吹干，加入50%甲醇水溶液复溶后进样分析检测。

表1流动相梯度洗脱程序

表2 AMP、ATP及ADP离子对信息（负离子模式）

1.7统计方法

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析。所有数据以均数±标准差表示，组间计量资料先进行小样本ShaPiro-Wilk正态分布检验，如2组数据服从正态分布，采用独立样本t检验，再进行方差齐性F检验。若2组间方差齐采用t检验，方差不齐采用t’检验。若组内数据不服从正态分布，将数据进行log10转换，再进行正态分布检验。2组数据不服从正态分布，采用非参数检验方法Mann-Whitney法对数据进行检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1健脾益肾方对顺铂致AKI小鼠血清肌酐和尿素氮的影响

与空白对照组比较，模型对照组血清肌酐、尿素氮水平显著增高（P<0.01），提示顺铂诱导AKI模型构建成功。与模型对照组比较，健脾益肾方干预组小鼠血清肌酐水平显著降低（P<0.01），尿素氮有下降趋势但没有统计学差异（P>0.05），提示健脾益肾方对顺铂诱导的AKI小鼠有保护作用。见表3。

2.2健脾益肾方对顺铂致AKI小鼠肾组织AMP、ATP、ADP含量的影响

表4结果显示：与空白对照组比较，模型对照组小鼠肾组织AMP含量显著降低（P<0.01）；与模型对照组比较，健脾益肾方干预组的AMP含量显著升高（P<0.05）。ATP、ADP指标，3组组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表3各组小鼠血清肌酐和尿素氮含量比较

表5结果显示：与空白对照组比较，模型对照组AMP/ATP比值显著降低（P<0.05）；与模型对照组比较，健脾益肾方干预组的AMP/ATP比值显著升高（P<0.05）。ADP/ATP比值，3组组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表4各组小鼠肾组织AMP、ATP、ADP含量比较

表5各组小鼠肾组织AMP/ATP、ADP/ATP比值比较

3、讨论

急性肾损伤（AKI）是由多种病因引起的肾功能快速下降而出现的临床综合征。顺铂临床肾损伤的发病率高达20%～46%[12,13,14]。顺铂是一种高效广谱抗癌药物，具有严重的肾毒性副作用[15,16]。顺铂诱导发生的肾损伤不仅包括短期内的肾功能指标异常，如血清肌酐、尿素氮的快速增加，还会引起慢性肾脏病的发生。既往研究[17,18,19,20,21,22]表明，氧化应激、氧化还原反应失衡、能量代谢稳态受损、细胞凋亡、炎症等病理生理过程参与顺铂诱导肾损伤的发生机制中。顺铂诱导的急性肾损伤动物模型也被广泛应用于慢性肾脏病（CKD）机制探讨的实验[12,13,14]。

肾脏能量代谢紊乱在AKI发生过程中起重要作用。但由于AMP、ATP、ADP指标对检测技术和条件要求很高，较难实现精确定量评估，致使AKI过程中关于AMP、ADP、ATP的研究较少。本研究通过超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（UPLC-QQQ-MS）构建了稳定、可靠的检测上述3个能量指标的方法，并在AKI小鼠肾组织进行定量检测，发现在AKI过程中肾组织存在显著的AMP下降。该结果与近期发表的运动诱发的AKI结论相似[23]。推测可能的机制为，AKI过程中，ATP再生不足时，机体出现显著的AMP聚集，进一步的缺氧导致AMP降解，以保持能荷稳态，降解的AMP快速代谢为尿酸。本研究结果显示，健脾益肾方预处理可以显著地提升AKI小鼠AMP水平，提高AMP/ATP比值，提示其可能会进一步激活AMPK信号通路，维持肾脏细胞的能量稳态，保护肾脏，从而降低顺铂诱导发生肾损伤。ADP/ATP比值是调节氧化磷酸化的基本因素[24]。本研究结果显示各组肾脏组织中ATP、ADP含量及ADP/ATP比值无统计学差异，一方面可能是与样本量小有关，另一方面提示AKI过程中氧化磷酸化过程可能处于相对稳定的状态。

综上所述，健脾益肾方可有效保护顺铂诱导AKI小鼠的肾功能，其机制可能与提高AMP、ATP能量代谢，维持肾脏细胞的能量稳态平衡有关。

参考文献:

[2]傅博,李顺民健脾益肾方台肾病治疗仪治疗慢性肾功能衰竭临床疗效观察[J]云南中医学院学报,2014,37(6):63-66.

[10]黄继汉,黄晓晖药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J]中国临床药理学与治疗学, 2004(9):1069-1072.

[11]沈剑箫,万鹏顺铂诱导的急性肾损伤中肾脏组织m6A甲基化水平的变化[J].上海交通大学学报(医学版) , 2021,41(12):13-1611,1602.

基金资助:国家自然科学基金青年项目(编号:81704012);广东省医学科学技术研究基金项目(编号:B2022155);深圳市科技计划项目(编号:JCYJ20220531091807018);

文章来源:古秀芬,吴瑕,黄静婷等.基于能量代谢调控探究健脾益肾方抗顺铂诱导小鼠急性肾损伤机制[J].广州中医药大学学报,2023,40(08):