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不同品牌ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中IL-8对比研究

2024-03-19 57 上传者：管理员

摘要：目的对比研究2种不同品牌ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中人白细胞介素-8(IL-8)水平情况。方法不同浓度聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激A549细胞10、24 h,收集细胞上清液，共获得40份样本，分为1～10组，每组4份。采用2种ELISA试剂盒(试剂盒A、试剂盒B)检测细胞培养上清液中IL-8水平，对比2个试剂盒检测得到的组间数据或同组数据的一致性或差异性。结果 2种试剂盒拟合曲线中相关系数值分别为：0.999 600、0.999 602,检测标准品结果相关性良好。试剂盒B检测样品1、2组中IL-8水平比较，差异有统计学意义(P<0.01),但试剂盒A检测样品1、2组中IL-8水平比较，差异无统计学意义(P>0.05);2种试剂盒检测样品8、9组及样品9、10组中IL-8水平比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。仅试剂盒B检测样品1、5组中IL-8水平明显低于试剂盒A,差异有统计学意义(P<0.01)。结论不同品牌ELISA试剂盒均可用于检测IL-8水平，但检测结果仍在一定程度上存在差异。为避免实验误差，研究中应尽量选择同一个厂家生产的同品牌试剂盒。

关键词：
上皮细胞
实验室检测
白细胞介素-8
细胞培养
酶联免疫吸附试验
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白细胞介素-8(IL-8)又称为趋化因子CXCL8,是一种具有强大中性粒细胞趋化活性的细胞因子，会引起组织损伤。各种免疫细胞、上皮细胞均可分泌IL-8[1,2]。IL-8介导细胞发育和炎症反应过程中的中性粒细胞迁移，因此其与许多炎症性疾病和肿瘤性疾病相关[3,4,5]。目前，IL-8已经从一种中性粒细胞趋化剂演变为多种炎症及肿瘤性疾病的治疗靶点[6]。因此，检测IL-8水平在科学研究中具有重要意义。目前，IL-8实验室检测技术主要包括酶联免疫吸附试验(ELISA)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Q-PCR)。ELISA是一种定量IL-8的可靠方法，操作简单。市场上有不同品牌ELISA试剂盒检测IL-8,价格不等，在检测范围和检测下限方面均有所不同，但不同厂家的试剂盒检测性能之间是否存在差异目前尚不清楚。本研究选取了2个不同厂家生产的ELISA试剂盒，检测细胞培养上清液中的IL-8水平，比较2种试剂盒的性能，分析检测结果之间的一致性及差异性，为下一步研究中选取合适的试剂盒提供参考依据。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞

肺腺癌上皮细胞A549细胞系由重庆医科大学附属儿童医院呼吸病研究室刘恩梅教授惠赠。

1.1.2主要试剂及器材

聚肌胞苷酸(Poly I:C)购自中国Med Chem Express公司(货号42424-50-0);DMEM液体培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；人IL-8 ELISA试剂盒分别购自武汉博士德公司(货号：EK0413)及北京四正柏公司(货号：CHE0011);311细胞培养箱购自德国Thermo Scientific公司；酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2方法

1.2.1 Poly I:C刺激A549细胞模型建立

A549细胞按每孔2.5×105铺板于24孔板中，待细胞单层生长至80%时，每孔分别加入含不同浓度Poly I:C(2μg/mL及20μg/mL)的DMEM培养基(含2%胎牛血清)500 mL进行刺激，细胞在37℃、5% CO2条件下培养。分别收集刺激10、24 h后细胞上清液，-80℃保存。将样品分为1～10组，每组4份。

1.2.2 ELISA检测及结果分析

博士德品牌为试剂盒A组，四正柏品牌为试剂盒B组。2种试剂盒检测原理均为双抗体夹心法，包被物均为抗人IL-8抗体，酶结合物均为链霉亲和素(HRP)标记的抗人抗体，显色液均为四甲基联苯胺(TMB),实验均在室温下进行，检测范围均为15.6～1 000.0 pg/mL。

ELISA检测步骤均严格按说明书操作。均在同一时间、同一条件下由实验经验丰富的实验人员独立完成，检测样本为同一样本。每个试剂盒的细胞培养上清液样本和标准品均采用双复孔实验。主要步骤内容相同：配制标准曲线样品浓度；加入标准品及样品，每个标准品或样品均按双复孔加样；37℃反应90 min;洗板(试剂盒A不洗板，甩干即可；试剂盒B需洗板);加生物素标记抗体，37℃反应60 min;洗板；加入酶结合物，37℃反应30 min;洗板；加入显色液TMB 37℃反应15～20 min;加入终止液；用酶标仪在450 nm上测定吸光度(A)值。

1.3统计学处理

对标准品及每份样本双复孔的2个A值取平均值，以标准品浓度为横坐标，A值为纵坐标，采用ELISA Calc软件绘制并选取最佳拟合曲线，计算结果。最终实验数据采用GraphPad 9.2软件进行统计分析，所有结果均以

表示，统计显著性分析采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 2种试剂盒检测标准品的拟合曲线比较

2种试剂盒均采用指数绘制拟合曲线，相关系数(R2)值分别为：0.999 600,0.999 602。见图1。

2.2 2种试剂盒检测不同样品组别中IL-8水平比较

对相邻样品组间存在差异的结果进行统计分析，结果显示：试剂盒B检测样品1、2组中IL-8水平比较，差异有统计学意义(P<0.01),但试剂盒A检测样品1、2组中IL-8水平比较，差异无统计学意义(P>0.05);2种试剂盒检测样品8、9组中IL-8水平比较，差异均有统计学意义(试剂盒A:P<0.001,试剂盒B:P<0.01);2种试剂盒检测样品9、10组中IL-8水平比较，差异均有统计学意义(试剂盒A:P<0.01,试剂盒B:P<0.001)。2种试剂盒其余各样品组间IL-8水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。

表1 2种试剂盒检测不同样品组别中IL-8水平比较

图1 2种试剂盒检测标准品的拟合曲线

图2 2种试剂盒对不同组别样品检测结果差异比较

2.3 2种试剂盒对同一样品组别中IL-8水平检测结果差异比较

仅样品1、5组中试剂盒B检测IL-8水平明显低于试剂盒A,差异有统计学意义(P<0.01),其余各样品组中试剂盒A、B检测IL-8水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1、图3。

图3 2种试剂盒对同一样品组别中IL-8水平检测结果差异比较

3、讨论

IL-8与多种炎症性疾病及肿瘤性疾病密切相关[1,2]。Poly(I:C)是病毒双链RNA(dsRNA)的模拟物，作为TLR3配体，能在体内外明显诱导气道上皮细胞和中性粒细胞产生lL-8[7]。本研究采用Poly(I:C)刺激A549细胞中IL-8产生，收集细胞培养上清液，选用2种不同品牌试剂盒，在同一条件下检测同一样本，结果发现，2个试剂盒检测标准品结果相关性良好，说明2个试剂盒均可用于IL-8水平的检测，且利用标准品绘制的拟合曲线可较好反映待测样品中IL-8的水平。比较不同样品组间检测数值及同一个样品组中2种试剂盒检测数据，二者总体上趋势一致，提示2种试剂盒检测一致性较好。IMTIAZ等[8]比较不同品牌的ELISA试剂盒对牛奶中黄曲霉毒素的定量测定结果，发现所有品牌ELISA试剂盒对黄曲霉毒素的定量测定效果相当，且定量均在可接受范围内，无假阳性或假阴性结果。分析本研究中2种试剂盒检测性能相对原因：可能是2种试剂盒检测原理、包被物、酶结合物均相同，检测过程均相似。2种试剂盒均为国产试剂盒，价格便宜，二者价格相当，实验过程简单，检测一致性相对较好，研究中均可选用。

本研究对比2种试剂盒检测得到的组间数据或同组数据，仍在一定程度上存在差异。较多研究显示，不同厂家试剂盒会对实验结果产生影响。一项研究比较3种ELISA试剂盒检测抗载脂蛋白A1的自身抗体，结果发现3种试剂盒之间存在实质性差异，血清阳性率检出率为1.9%～24.5%[9]。另一项研究比较2种试剂盒对治疗克罗恩病的乌司奴单抗浓度进行检测，结果发现试剂盒A、B测得的中位谷浓度分别为0.26、0.38 mcg/mL。低谷浓度时，试剂盒A在许多情况下不能检测到，并且测量值为0,而试剂盒B即使在低浓度下也显示其相对值[10]。余悠悠等[11]比较了3种ELISA试剂盒检测血清抗酿酒酵母菌抗体的结果，发现不同试剂盒间的检测结果亦不完全一致。李红等[12]对比2个厂家生产的试剂检测大鼠血清碱性磷酸酶，虽然结果相关性良好，但结果比较，差异有统计学意义(P<0.05)。MÜLLER等[13]研究结果显示，尽管采用2种检测原理和方法均相同的ELISA试剂检测血清中病毒中和抗体水平，2种试剂盒特异性甚至敏感性上均存在令人惊讶的差异。采用不同ELISA试剂盒也会影响疾病流行病学的研究结果[14]。VAN DEN HOOGEN等[15]比较了5种商业试剂盒对疟疾抗体的检测情况，并结合流行病学分析，发现有3种试剂盒存在灵敏度低、特异性差、对弓形虫的交叉反应性高等缺点，而其中一种试剂盒能最准确地描述历史和最近的疟疾传播模式，相反，有些试剂盒的结果却不能反映出疟疾在任何一种情况下的传播模式。另一项研究对比了不同试剂盒对弓形虫的检测情况，发现不同试剂盒特异性也不同，而某些试剂盒对弓形虫的假阳性检出结果更多，强调需要用不同的血清学检测技术来确定疾病状态[16]。结合众多研究，分析本研究中2个试剂盒存在差异的原因可能与不同厂家ELISA试剂盒制作的原材料、制作工艺、酶标板包被技术、不同厂家抗体的来源及纯化方式存在差异等有关[17,18,19]。此外，基质的选择(血浆和血清)也影响抗体的检出结果及血清阳性率[9]。本研究中，虽然2个ELISA试剂盒对IL-8检测水平存在一定程度的差异，但它们肯定能检测到样品中绝大多数的IL-8水平。不同ELISA试剂盒检测得到的结果之间不可互换[20]。IL-8水平检测的准确性在研究中至关重要，使用的试剂对检测结果会存在影响，提示研究中应避免更换试剂盒，其次重复验证实验结果、采取多种方法证实研究结果至关重要。

综上所述，2种不同品牌ELISA试剂盒均可用于检测IL-8水平，检测结果大体一致，但仍在一定程度上存在差异。实验如要进行对比研究，尽量选择同一个厂家生产的同品牌试剂盒，不应随意更换试剂盒，避免实验误差。

参考文献:

[2]范傲,黄钟,段宇清,等.慢性阻塞性肺疾病患者血浆中性粒细胞胞外诱捕网和白细胞介素8及白细胞介素-33的表达水平及其临床意义[J]中国呼吸与危重监护杂志,2022,21(2):84-89.

[3]赵睿,袁昆,张跃栋,等IL-6､IL-8､CRP､PCT联合检测在儿童感染性疾病中的诊断价值及临床可报告范围研究[J]医学动物防制,2022 ,38(2):197-200.

[4]朱晓菡,林爱琴,寇应琳,等.血清IL-8与TNF-a和MCP-1对革兰阴性菌感染呼吸机相关性肺炎的诊断价值[J].中华医院感染学杂志,2021,31(23):3532-3536.

[5]马慧颖,刘翔宇,李文静,等卵巢癌患者血清MMP-9和IL-8水平及其临床价值[J]现代妇产科进展,2021,30(8):571-574.

基金资助:国家自然科学基金地区科学基金项目(81860003; 81960001);贵州省科技厅高层次创新型人才(千层次)项目(GZSYQCC2023011号);贵州省贵阳市科技局重大专项计划(筑科合同[2022]-4-1号);贵州省中医药管理局中医药､民族医药科学技术研究课题(QZYY-2018-010);贵州省卫健委科学技术基金项目(gzwjw2018-1-049);

文章来源:张梅,阳小凤,饶忠美等.不同品牌ELISA试剂盒检测细胞培养上清液中IL-8对比研究[J].现代医药卫生,2024,40(05):741-744+749.