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桑白皮总黄酮对小鼠肺癌模型的影响及相关机制

2024-05-31 43 上传者：管理员

摘要：目的探讨桑白皮总黄酮对小鼠肺癌模型的影响及相关机制。方法将小鼠分为空白对照组(20只),模型组(14只),桑白皮总黄酮低(16只)、中(16只)、高剂量组(18只)。使用乌拉坦诱导建立小鼠肺癌模型，从造模首日开始，桑白皮总黄酮低、中、高剂量组分别灌胃桑白皮总黄酮15、30、60 mg/kg,对照组、模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，1次/d,连续16周，第16周试验结束时统计各组存活小鼠的肺癌发生率、肺肿瘤结节数量。酶联免疫吸附法检测血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、神经特异性烯醇化酶(NSE)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原199(CA199)浓度；免疫组化法检测小鼠肺组织中N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白表达阳性率；Western blot检测小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平。结果肺癌发生率、肺肿瘤结节数量在各组间比较差异具有统计学意义(P<0.01),各剂量桑白皮总黄酮组肺癌发生率、肺肿瘤结节数量均明显低于模型组(P<0.05);随着桑白皮总黄酮剂量的增加，肺癌发生率、肺肿瘤结节数量下降幅度逐渐明显。模型组血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、NSE、CA125、CA199明显高于空白对照组(P<0.01),各剂量桑白皮总黄酮组血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、NSE、CA125、CA199明显低于模型组(P<0.01);随着桑白皮总黄酮剂量的增加，血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、NSE、CA125、CA199浓度逐渐降低。模型组小鼠肺组织中N-钙黏蛋白表达阳性率明显高于空白对照组，E-钙黏蛋白表达阳性率明显低于空白对照组(P<0.01),与模型组比较，各剂量桑白皮总黄酮组小鼠肺组织中N-钙黏蛋白表达阳性率明显降低，E-钙黏蛋白表达阳性率明显升高(P<0.05);随着桑白皮总黄酮剂量的增加，上述变化逐渐明显。模型组小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平明显高于空白对照组(P<0.01),与模型组比较，各剂量桑白皮总黄酮组小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平明显降低(P<0.05);随着桑白皮总黄酮剂量的增加，PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平逐渐下降。结论桑白皮总黄酮能够有效抑制乌拉坦诱导的小鼠肺癌发生及血清肿瘤标志物和上皮-间质转化过程，可能与抑制PI3K/AKT信号通路活化有关。

关键词：
PI3K/Akt信号通路
上皮-间质转化
小鼠
桑白皮总黄酮
肺癌
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肺癌是一种常见的呼吸系统恶性肿瘤，受环境、吸烟、遗传等多种因素影响[1]。我国肺癌发病率呈逐年上升趋势，主要与人口老龄化、环境污染、吸烟等因素有关，随着肺癌发病率上升，其死亡率也相应提高，且城市的发病率高于农村地区[2]。目前，肺癌的临床治疗主要基于癌症分期和患者整体健康状况确定，治疗方式主要有手术切除、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗等[3]。中医药在肺癌治疗中也具有重要作用。作为肺癌治疗中的辅助手段，中医药与手术、放疗、化疗等相结合，可提高临床治疗效果；此外中医药能够减轻西医治疗过程中的副作用，进而提高患者的生活质量[4]。桑白皮总黄酮是从桑树树皮中提取的一种天然植物化合物，在肿瘤治疗中可能具有一定的应用潜力[5],目前关于桑白皮总黄酮对肺癌的疗效和相关机制研究仍十分少见。本研究使用乌拉坦诱导建立小鼠肺癌模型，探讨桑白皮总黄酮对小鼠肺癌模型的影响及相关机制。

1、材料与方法

1.1动物与主要试剂

健康SPF级ICR小鼠(南京普莱柯生物技术有限公司，许可证号：SYXK(苏)2023-0086)6～8周龄，体质量18～22 g, 12 h/d光照，食水不限。

桑白皮总黄酮(南京植佰萃生物有限公司);血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、神经特异性烯醇化酶(NSE)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原199(CA199)酶联免疫检测试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司);Western blot检测中使用的一抗和二抗(上海金畔生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠分组与肺癌模型建立

将小鼠分为空白对照组(20只),模型组(14只),桑白皮总黄酮低(16只)、中(16只)、高剂量组(18只)。使用乌拉坦诱导建立小鼠肺癌模型。小鼠麻醉后，腹腔注射乌拉坦，注射量根据小鼠体质量确定，通常为每kg体质量1 mL乌拉坦，注射后观察小鼠的反应，并记录肿瘤生长情况。在注射乌拉坦4～6周后，通过病理检查确定建模是否成功。从造模首日开始，桑白皮总黄酮低、中、高剂量组分别灌胃桑白皮总黄酮15、30、60 mg/kg,对照组、模型组灌胃给予等体积蒸馏水，1次/d,连续16周。第16周试验结束时统计各组存活小鼠的肺癌发生率、肺肿瘤结节数量。

1.2.2各组小鼠血清肿瘤标志物浓度检测

第16周试验结束时，乙醚吸入麻醉后摘小鼠眼球取血，4℃冷藏静置1 h,离心收集血清，-80℃冷冻保存待测。酶联免疫吸附法检测血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、NSE、CA125、CA199浓度。检测过程：将清洗并预处理后的微孔板表面涂布特异性抗体，作为捕获抗体固定特定的肿瘤标志物；将无活性蛋白加入孔中阻断未固定的活性位点，以减少背景信号；将血清样品加入微孔板，与固定抗体发生特异性结合，孵育一段时间，使抗原与特异性抗体充分结合，并洗掉未结合的样品，移除干扰物质；加入与特异性抗体来源不同的酶标记二抗，反应一段时间后洗涤掉未结合的二抗；加入特定底物，使酶催化产生可见的色素反应产物，加入酸性停止溶液，中止底物反应；使用酶标仪测量反应产物的荧光强度，与标准曲线比较，并计算样品中标志物含量。

1.2.3各组小鼠肺组织中N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白表达阳性率检测

第16周试验结束时，取各组小鼠肺组织，固定和石蜡包埋，切割成5μm薄片，并放置在载玻片上；将切片置于热蒸馏水中进行抗原解蔽，使蛋白质的抗原表位暴露；将特异性的一抗抗体加在切片上，孵育，使抗体与组织中相应的蛋白发生特异性结合；洗涤切片，以去除未结合的一抗抗体；加入标记有特定色素的二抗与之前结合的一抗发生特异性结合，洗涤切片，去除未结合的二抗；加入染色底物，使二抗酶联物催化产生可见的沉积物，显微镜下观察切片，以评估蛋白表达情况。

染色强度评估：0为无染色，1+为弱阳性染色，2+为中等阳性染色，3+为强阳性染色；阳性细胞比例评估：0为<10%,1+为10%～30%,2+为31%～60%,3+为>60%;计算以上两项评分的乘积，>3分为阳性表达。

1.2.4 Western blot检测小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达

取各组小鼠肺组织切片，置于热蒸馏水中进行抗原修复，切片脱蜡后使用磷酸缓冲液洗涤，以去除多余脂肪和抗原修复试剂；使用RIPA裂解缓冲液从肺组织切片中提取蛋白质，提取过程中可使用磷酸酶抑制剂保持蛋白质的磷酸化状态；对提取的蛋白质进行定量，将蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，并将电泳后的凝胶进行转膜，转移后的膜用5%脱脂奶粉或相应封闭液进行封闭，以减少非特异性结合；将膜与特异性的一抗共同孵育12 h,一抗包括PI3K兔源单克隆抗体(1500稀释)、AKT兔源单克隆抗体(11 000稀释)、p-AKT兔源单克隆抗体(1500稀释)、GAPDH兔源单克隆抗体(1200稀释);次日洗涤膜，以去除未结合的一抗，将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育2 h;洗涤膜，去除未结合的二抗；将膜放入含有底物的显色液中进行显色反应，再放入水中，终止显色反应；进行拍照和分析，计算目标蛋白质的相对表达量。

1.3统计学分析

应用SPSS 25.0对数据进行处理与统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差

表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料以n(η/%)表示，组间比较进行χ2检验。P<0.05为差异具统计学意义。

2、结果

2.1各组小鼠肺癌和肺肿瘤结节发生情况

本研究结果显示，肺癌发生率、肺肿瘤结节数量在各组间比较差异具有统计学意义(P<0.01);各剂量桑白皮总黄酮组肺癌发生率、肺肿瘤结节数量均明显低于模型组(P<0.05);随着桑白皮总黄酮剂量的增加，肺癌发生率、肺肿瘤结节数量下降幅度逐渐明显，见表1。

2.2各组小鼠血清肿瘤标志物水平

本研究结果显示，模型组血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、NSE、CA125、CA199明显高于空白对照组(P<0.01);各剂量桑白皮总黄酮组血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、NSE、CA125、CA199明显低于模型组(P<0.05);随着桑白皮总黄酮剂量的增加，血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、NSE、CA125、CA199浓度逐渐降低，见表2。

表1各组小鼠肺癌和肺肿瘤结节发生情况

表2各组小鼠血清肿瘤标志物水平

2.3各组小鼠肺组织中N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白表达阳性率

本研究结果显示，模型组小鼠肺组织中N-钙黏蛋白表达阳性率明显高于空白对照组，E-钙黏蛋白表达阳性率明显低于空白对照组(均P<0.01);与模型组比较，各剂量桑白皮总黄酮组小鼠肺组织中N-钙黏蛋白表达阳性率明显降低，E-钙黏蛋白表达阳性率明显升高(均P<0.05);随着桑白皮总黄酮剂量的增加，上述变化逐渐明显，见表3。

2.4各组小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平

本研究结果显示，模型组小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平明显高于空白对照组(P<0.01);与模型组比较，各剂量桑白皮总黄酮组小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平明显降低(P<0.05);随着桑白皮总黄酮剂量的增加，PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平逐渐下降，见表4。

表3各组小鼠肺组织中N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白表达阳性率

表4各组小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平

3、讨论

中医药作为一种辅助手段在肺癌治疗中发挥多方面作用，可改善患者症状，调节免疫功能，提高生活质量，延长生存期；还能减轻化疗药物的不良反应，增强治疗效果，提高患者耐受性[6]。此外，部分中药单体具有抗肿瘤作用，能够协同化疗药物增强治疗效果，减少耐药性[7]。相关研究[8]显示，桑白皮总黄酮通过影响细胞周期、诱导细胞凋亡及抑制血管生成等途径抑制肿瘤细胞的生长和扩散。桑白皮总黄酮富含多种活性物质，具有较强的抗氧化能力，能够中和自由基，减轻氧化应激对细胞的损害，而氧化应激是肿瘤发生发展的一个重要环节，抗氧化作用对于肿瘤治疗具有一定意义[9]。慢性炎症与肿瘤的发生发展密切相关，桑白皮总黄酮具有一定的抗炎能力，能够抑制炎性细胞因子产生和炎症介质释放，从而减轻炎症反应，并抑制肿瘤进展[10]。但桑白皮总黄酮在肺癌治疗中的作用及相关机制研究仍十分少见。

本研究使用乌拉坦诱导建立小鼠肺癌模型，同时使用不同剂量的桑白皮总黄酮进行干预。结果显示，桑白皮总黄酮各剂量组肺癌发生率、肺肿瘤结节数量均明显低于模型组(P<0.05);随着桑白皮总黄酮剂量的增加，肺癌发生率、肺肿瘤结节数量下降幅度逐渐明显，提示乌拉坦能够成功诱导建立小鼠肺癌模型；桑白皮总黄酮可抑制乌拉坦对肺癌的诱导作用，且随着桑白皮总黄酮浓度的提高，抑制作用逐渐明显。癌胚抗原应用于肺癌等多种恶性肿瘤的诊断和临床监测，其水平升高与肿瘤进展和预后不良有关[11,12]。NSE是在神经组织和神经内分泌细胞中高表达的一种酶，也是肺癌等神经内分泌细胞肿瘤的标志物[13]。CA125、CA199在肺癌等多种恶性肿瘤中的高表达，可能与肿瘤的进展和预后不良相关[14]。本研究中，模型组小鼠血清鳞状上皮细胞癌抗原、癌胚抗原、NSE、CA125、CA199明显高于空白对照组(P<0.01),各剂量桑白皮总黄酮组上述血清肿瘤标志物明显低于模型组(P<0.05);且随着桑白皮总黄酮剂量的增加逐渐降低，提示桑白皮总黄酮能够有效降低肺癌小鼠的血清肿瘤标志物，可能与改善肺癌病情有关。

上皮-间质转化是细胞生物学中的一个重要过程，其涉及上皮细胞和间质细胞之间的转换；在肺癌发展中，上皮-间质转化可能起到重要作用[15]。本研究中，各剂量桑白皮总黄酮组小鼠肺组织中N-钙黏蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.05),E-钙黏蛋白表达水平明显高于模型组(P<0.05),随着桑白皮总黄酮剂量的增加上述变化逐渐明显。N-钙黏蛋白高表达可能为癌细胞提供了较强的细胞间黏附，进而促进肺癌发生；E-钙黏蛋白在肿瘤细胞中低表达会导致细胞间黏附性降低，促使癌细胞发生侵袭和转移[16]。结合本研究结果可知，桑白皮总黄酮可通过降低N-钙黏蛋白表达、增加E-钙黏蛋白表达而抑制乌拉坦诱导肺癌上皮-间质转化过程。PI3K/AKT信号通路与恶性肿瘤的发展密切相关，在癌细胞增殖、存活、侵袭和转移中起着关键作用[17];过度活化的PI3K会导致细胞内信号传导通路异常激活，促进肿瘤生长和转移[18];AKT是PI3K信号通路的直接下游效应器，当PI3K信号通路被激活时能够活化AKT,激活的AKT通过磷酸化调节多个靶蛋白，进一步影响细胞生长、凋亡、增殖和侵袭等过程[19]。本研究中，桑白皮总黄酮各剂量组小鼠肺组织中PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.05);且随着桑白皮总黄酮剂量的增加其表达水平逐渐下降，提示桑白皮总黄酮可通过抑制PI3K/AKT信号通路活化抑制乌拉坦诱导的小鼠肺癌病情发展。

参考文献:

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基金资助:江苏省老年健康基金项目(LK2021022);江苏省血地寄防科研项目(X202104);

文章来源:郭楠楠,苏翔宇,杜海娜,等.桑白皮总黄酮对小鼠肺癌模型的影响及相关机制[J].北华大学学报(自然科学版),2024,25(04):454-459.