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运动和饮食对肥胖小鼠肝脏细胞的影响

2021-09-03 543 上传者：管理员

摘要：目的:探究饮食控制、有氧运动及结合控制饮食的有氧运动三种不同干预方式对肝脏细胞自噬的影响。方法:将32只刚断乳的4周龄C57BL/6J小鼠随机分成5组,每组给予不同干预措施,实施8周后进行取材,使用Western-Blot分别测定肝脏P62、LC3-Ⅱ的蛋白表达水平。结果:高脂饮食喂养引起肥胖组小鼠体重、腹部脂肪含量、lee’s指数、TG浓度、TC浓度、LDL-C浓度、P62表达量升高,HDL-C浓度、LC3-Ⅱ表达量降低;8周干预后,肥胖饮食运动干预组变化最显著。结论:有氧运动和饮食控制均可使小鼠肝脏细胞自噬蛋白P62表达水平降低,LC3-Ⅱ表达水平升高,促进肝脏细胞生理性自噬进而有效改善肝脏内脂代谢紊乱;而运动结合饮食控制效果更明显。

关键词：
三种不同干预方式
肝脏细胞自噬
肥胖小鼠
运动和饮食干预
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随着生活水平的不断提高，饮食中脂肪的含量逐渐增加，患肥胖、高脂血症及肝脏代谢紊乱疾病的人群逐年增加[1]。肥胖人群肝脏脂肪过量堆积会引起代谢紊乱疾病，如非酒精性脂肪肝（NALFLD）。非酒精性脂肪肝的发生与体重指数以及肥胖的程度成正相关，是肝硬化的诱发因素，威胁着人类的健康。数据显示，每年新增的脂肪肝患者中超过一半都属于肥胖人群，肥胖人群患NAFLD的几率比普通非肥胖人群高4.6倍，肥胖者的肝脏代谢能力不足，造成肝脏内脂肪堆积，从而引发代谢紊乱疾病[2]。研究发现，肝脏细胞生理性自噬受抑制时易发生内质网应激和脂毒性，如果没有及时改善，肝脏中的脂质积累就会增多，导致自噬小体的膜结构发生改变引起自噬水平降低，抑制自噬小体与溶酶体结合，进而影响自噬降解脂质的作用[3,4]，肝脏P62、LC3-Ⅱ的蛋白表达量可检测自噬水平[5]。已有研究发现通过增加运动和改变饮食习惯等方式可有效缓解NAFLD，甚至可以完全恢复。因此，本文通过探讨肥胖引起的肝脏细胞生理性自噬异常的分子机制去寻找有效的防治方法。

1、研究对象与方法

1.1研究对象

选取刚断乳的C57BL/6J小鼠40只作为实验对象，随机选取6只作为正常对照组，其余34只用于建立肥胖模型。用普通饲料喂养正常对照组小鼠，高脂饲料喂养肥胖造模小鼠，喂食12周并自由饮水。12周喂养结束后，根据肥胖模型的成功标准（肥胖模型小鼠的平均体重超过正常对照组小鼠平均体重的20%）确定是否造模成功。剔除4只肥胖抵抗小鼠和4只死亡小鼠，造模成功26只（见表1）。

表1小鼠建模前后体重对比

1.2研究方法

1.2.1实验法

1.2.1.1干预方案

将造模成功的26只小鼠按体重分层随机分为四组：肥胖对照组（FC,n=6）、肥胖运动干预组（FE,n=7）、肥胖饮食干预组（FN,n=6）、肥胖饮食运动干预组（FNE,n=7）。分组后，FN组和FNE组小鼠改换普通饲料喂养；FE组和FNE组小鼠进行跑台运动，运动方案为每周运动6天，每次运动60min，跑速20m/min，共运动8周。小鼠饮食及运动方案具体见表2。在实验期间，小鼠的体重需每周测量一次，记录饮食饮水情况，并观察小鼠的健康状况。

表2小鼠饮食及运动方案下载原表

表2小鼠饮食及运动方案

1.2.1.2测试指标

在小鼠最后一次运动后的36～40h内记录小鼠的体重、体长并计算Lee’s指数：，单位分别是g和cm。禁食12h后在腹腔注射麻醉（10%水合氯醛）进行取材，分离小鼠肝脏后按取材前设计的编号放置，放入液氮速冻后转入-80℃超低温冰箱保存。腹腔脂肪组织重量测定：小鼠麻醉取血后，用手术刀打开小鼠腹腔，取出腹腔内的脂肪后放在电子天平上称重。ELISA法测定肝脏血液指标：使用ELISA试剂盒测定小鼠肝脏血液中血脂四项的变化情况；WesternBlot分析：由三个部分组成包括凝胶电泳、样品蛋白印迹和免疫学检测。

1.2.2数理统计法

运用SPSS19.0统计软件对各项指标进行数据处理，结果用平均数±标准差±S表示。运用单因素方差分析比较组间均数是否有差异，若方差不齐，用Games-Howell法进行均数的多重比较。FC组与FNE组采用双因素方差分析进行比较。以P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示具有非常显著性差异。

2、结果与分析

2.1小鼠身体成份的变化情况

如表3所示，FC组小鼠的体重、腹腔脂肪含量较NC组小鼠非常显著升高（P<0.01),lee’s指数显著升高（P<0.05），说明高脂饮食会导致小鼠体重和腹腔脂肪含量升高，引起小鼠肥胖。FE组、FN组小鼠的体重、腹部脂肪含量较FC组小鼠非常显著降低（P<0.01),lee’s指数略有降低，但没有显著性差异（P>0.05），说明单一的饮食控制和有氧运动均可降低小鼠的体重和腹腔脂肪含量。FNE组小鼠与FC组、FE组、FN组小鼠进行比较，体重、腹腔脂肪含量、lee’s指数均非常显著降低（P<0.01），说明运动结合饮食干预肥胖的效果更加明显。

表3各组小鼠身体成份的变化情况（±S)

2.2小鼠血脂四项浓度的变化情况

如表4所示，高脂饮食喂养的FC组小鼠血脂四项与NC组相比均有非常显著性差异（P<0.01），其中甘油三脂TG、血清点胆固醇TC、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C浓度非常显著性升高，HDL-C浓度非常显著性降低。与FC组小鼠相比，FE组小鼠的TC、LDL-C浓度非常显著性降低（P<0.01),TG浓度显著性降低（P<0.05),HDL-C浓度非常显著性升高（P<0.01);FN组小鼠的TG、TC、LDL-C浓度非常显著性降低（P<0.01),HDL-C浓度非常显著性升高（P<0.01）。FNE组小鼠与FC组小鼠比TG、TC、LDL-C浓度均非常显著性降低（P<0.01),HDL-C浓度非常显著性升高（P<0.01）；与FE组小鼠相比HDL-C浓度显著性升高（P<0.05），其余指标略有降低，但无显著性差异（P>0.05）；与FN组小鼠相比TC、LDL-C浓度非常显著性降低（P<0.01），其余指标有变化，但无显著性差异（P>0.05）。说明三种干预方式都可有效改善肥胖小鼠的血脂。

表4小鼠血脂四项浓度变化情况(±S)

2.3运动干预和饮食控制下小鼠肝脏P62、LC3-Ⅱ蛋白表达的变化情况

如表5所示与NC组相比，FC组小鼠肝脏的自噬蛋白P62表达量显著性升高（P<0.01),LC3-Ⅱ蛋白表达量显著性降低（P<0.01）。FE组小鼠相比于FC组小鼠而言，其肝脏P62蛋白的表达量显著性降低（P<0.01),LC3-Ⅱ蛋白表达量显著性升高（P<0.05）。与FC组进行对照，FN组小鼠肝脏的P62蛋白表达显著性降低（P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白表达显著性升高（P<0.05）。分别对比FNE组小鼠和FC组FE组、FN组小鼠，发现FNE组小鼠肝脏的P62蛋白表达量显著性降低（P<0.01),LC3-Ⅱ蛋白表达量显著性升高（P<0.01）。由此可见，饮食控制、有氧运动及有氧运动结合饮食控制均可促进肝细胞生理性自噬且运动结合饮食干预效果更明显。

表5各组小鼠肝脏P62、LC3-Ⅱ蛋白表达水平（±S)

3、分析与讨论

3.1不同干预方式对肥胖小鼠体重、腹部脂肪含量、lee’s指数的影响

实验结果显示，20周高脂饲料喂养使小鼠的体重、腹腔脂肪含量均明显升高，造成小鼠单纯性肥胖，提示长期的高脂饮食会引起单纯性肥胖，体重增加，脂肪含量增多，体内能量代谢失衡。

本实验对肥胖小鼠施加8周运动干预后，小鼠的体重下降16.07%、腹腔脂肪重量下降55.90%,lee’s指数下降3.67%，提示合理的有氧运动会降低体脂含量，减轻体重进而改善肥胖。据大量实验结果显示，有氧运动可以促进脂肪的水解，将堆积的脂肪分解成甘油和脂肪酸，进入血液循环，参与能量供应，减小体内脂肪细胞的数量和体积，降低体脂含量[6]。高脂饮食喂养的大鼠经过8周跑台运动后，体重和体脂含量都明显低于相同高脂饮食喂养但不运动的大鼠[7]。进行4周的跑台运动或7周的游泳运动，也可有效降低肥胖大鼠的体重及体脂含量[8]。此外，人体实验也证实了4周的有氧运动可降低肥胖儿童的体重、体脂率，同时提出结合饮食控制的有氧运动可有效改善脂代谢紊乱[9]。8周饮食干预后，小鼠的体重下降15.55%、腹腔脂肪含量下降42.73%、lee’s指数下降0.38%；饮食结合运动干预组小鼠的体重下降32.84%、腹腔脂肪含量下降85.45%、lee’s指数下降5.79%；且FNE组小鼠的体重、腹腔脂肪含量、lee’s指数也显著低于FN和FE组，提示控制饮食摄入可以降低肥胖小鼠的体重和脂肪含量，饮食结合运动干预比单一干预效果明显。郭燕等人[10]在研究中发现，将高脂饲料喂养的大鼠改换普通饲料喂养后，其体重呈明显的下降趋势，且在控制饮食的基础上进行耐力运动比单一的饮食或运动干预体重下降的更加明显。

3.2不同干预方式对肥胖小鼠甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度的影响

20周高脂饲料喂养的小鼠血液指标发生明显变化：甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度升高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度降低，提示肥胖状态下脂代谢功能异常。8周运动干预后，FE组小鼠甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度降低，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度升高，提示运动可以改善脂代谢异常。8周的饮食干预以及饮食结合运动干预后，FN组、FNE组小鼠甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度降低，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度升高；且FNE组小鼠甘油三酯（TG）、血清总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度低于FE组、FN组，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）浓度高于FE组、FN组。提示控制饮食是改善脂代谢异常的有效方法，但饮食结合运动干预是否比单一干预效果更加明显还需要进一步研究证实。

3.3不同干预方式对肥胖小鼠肝脏细胞自噬相关蛋白表达的影响

自噬是一个高度保守的降解系统，通过自噬体和溶酶体的融合参与分解代谢，实现细胞自身代谢和某些细胞器的更新，在肥胖病理条件下发现自噬异常[11]。有研究表明P62是肝脏细胞自噬的调控因子，P62蛋白表达升高提示肝脏细胞生理性自噬机制受损，运动能有效改善自噬缺陷，LC3-Ⅱ是自噬形成的标志，其蛋白表达降低提示肝脏细胞生理性自噬受到阻碍。有研究表明P62是肝脏细胞自噬的调控因子，LC3-Ⅱ是自噬形成的标志[12,13]，为探究肥胖小鼠脂质代谢异常的分子机制，本研究对小鼠肝脏细胞自噬的相关蛋白P62、LC3-Ⅱ表达进行了检测，结果发现20周高脂饲料喂养的小鼠肝脏中P62蛋白表达量升高、LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低，提示肝脏细胞生理性自噬机制受损。8周运动干预后，FE组小鼠肝脏P62蛋白的表达水平降低，LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高，提示肝脏细胞生理性自噬得到改善[14]，但细胞自噬是一个多步骤调节的过程，信号传导非常复杂，目前研究尚未完全明确[15,16]。8周的饮食干预后，FN组小鼠肝脏P62蛋白表达水平降低，LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高，提示控制饮食是改善脂代谢异常的有效方法[17,18];FNE组小鼠肝脏P62蛋白表达水平低于FE组、FN组，LC3-Ⅱ蛋白表达水平高于FE组、FN组，提示饮食结合运动干预比单一干预效果更加明显。

4、结论

4.1长期单纯高脂饮食喂养的小鼠会出现血脂异常、脂质代谢紊乱的现象，且肝脏内细胞自噬相关蛋白P62表达水平升高，LC3-Ⅱ蛋白表达水平降低。

4.2有氧运动和饮食控制均可使小鼠肝脏内P62蛋白表达水平降低，LC3-Ⅱ蛋白表达水平升高，促进肝脏细胞自噬进而有效改善肝脏内脂代谢紊乱，其中运动干预结合饮食控制要比单一的运动干预或饮食控制效果明显。

参考文献：

[1]刘灿雪,李静.非酒精性脂肪肝的研究现状[J].锦州医科大学学报,2018,39(1):108-112.

[2]黄莹,张芳,丁文军.肝脏脂质代谢与自噬[J].中国科学院大学学报,2016,33(4):570-575.

[3]徐玲,马红艳,杨军,等.高脂饮食通过p-AMPK/mTOR信号通路下调小鼠肝细胞自噬水平[J].基础医学与临床,2018,38(1):37-41.

[4]王卉莹.饮食/运动对肥胖小鼠肝脏APPL1/AKt2信号通路的影响及其与TRB3关系的研究[D]J.沈阳:沈阳体育学院,2017.

文章来源：张博雅.运动、饮食干预对肥胖小鼠肝脏细胞自噬的影响[J].辽宁体育科技,2021,43(05):62-66.