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乳酸代谢相关的SERPINE1基因与胃癌患者临床预后的关系

2024-11-14 92 上传者：管理员

摘要：目的探讨乳酸代谢相关的SERPINE1基因与胃癌(GC)临床预后的关系。方法该研究纳入了2018年1月至2020年12月在该院接受手术切除治疗的89例GC患者。在初步实验中，该文分析了来自Ⅰ期(n=12)和Ⅳ期(n=12)GC患者的24份血清样本中5个乳酸代谢相关的基因(F5、MTTP、SERPINE1、CYP19A1、SLC52A3)的水平。在第二步中，将初步试验中Ⅳ期GC患者和Ⅰ期GC患者血清中发生显著改变的候选基因在一个更大的独立队列中进行验证，该队列包括65例GC患者和22例健康对照者的血清样本。结果在初步实验中分析的乳酸代谢相关的基因(F5、MTTP、SERPINE1、CYP19A1、SLC52A3)中，与Ⅰ期GC相比，在Ⅳ期患者的血清中SERPINE1显著上调(P<0.001)。GC患者血清SERPINE1的表达水平显著低于健康对照组，差异有统计学意义(P<0.000 1)。此外，SERPINE1表达水平随着肿瘤TNM分期的进展而升高(P<0.05)。基于受试者工作特征曲线分析血清SERPINE1对总生存(OS)率的最大预测值[曲线下面积为0.725,截断值为0.002 1],将GC患者分为高表达组(n=39)或低表达组(n=26)。与血清SERPINE1低表达组相比，血清SERPINE1高表达组静脉浸润、 T3/T4期、淋巴结转移、远处转移例数显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。SERPINE1低表达的GC患者的OS率明显高于SERPINE1高表达的患者，差异有统计学意义(P<0.05)。多变量分析显示，血清SERPINE1高表达(HR=4.51,95%CI:1.23～23.69,P=0.021)是预测GC患者不良预后的独立预后标志物。结论血清乳酸代谢相关的SERPINE1基因可作为GC预后的可靠生物标志物。

关键词：
GC
乳酸
癌症
胃癌
血清
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胃癌(GC)作为一个严重的全球健康问题，是癌症相关死亡的第四大原因[1],我国2020年新诊断出超过40万人患有GC[2]。大多数GC病例通常直到晚期才被诊断出来，导致预后不良[3]。尽管由于联合治疗，GC患者的总生存(OS)率已经大大提高，但由于个体预后的巨大差异，仍然难以评估GC患者的预后[4]。近年来，能量代谢的重新编程已成为癌症的新兴特征[5]。研究发现GC细胞在富氧条件下摄取大量葡萄糖并代谢成乳酸盐，称为“Warburg效应”[6]。乳酸作为一种信号分子，在肿瘤微环境中的代谢途径和免疫反应的调节中发挥重要作用，与GC的发生、侵袭、转移、耐药性和不良预后密切相关[7]。最近一项生物信息分析筛选出并证实了5个乳酸代谢相关的基因(F5、MTTP、SERPINE1、CYP19A1、SLC52A3)可用于GC患者的预后预测，然而该研究并没有探讨它们在GC患者血清中表达的临床意义[8]。因此，在这项研究中，本文重点分析了GC患者血清中这5个乳酸代谢相关的基因表达。首先，在一小部分样本中，本文通过比较Ⅰ期和Ⅳ期GC患者血清中的表达水平来选择与转移相关的候选基因。接下来，本文利用一个更大的、独立的来自GC患者和健康对照的血清样本队列，验证了所选基因的临床意义。

1、资料与方法

1.1 一般资料

本研究纳入了2018年1月至2020年12月在本院接受手术切除治疗的89例GC患者为研究组。在初步实验中，本文分析了来自Ⅰ期(n=12)和Ⅳ期(n=12) GC患者的24份血清样本中5个乳酸代谢相关的基因(F5、MTTP、SERPINE1、CYP19A1、SLC52A3)的水平。在第二步中，将初步试验中Ⅳ期GC患者和Ⅰ期GC患者血清中发生显著改变的候选基因在一个更大的独立队列中进行验证，该队列包括65例GC患者和22例健康对照者的血清样本。这些患者包括45例男性和20例女性，平均年龄为(68.0±12.5)岁。纳入标准：(1)具有某些临床症状，包括吞咽困难、消化不良、消化道出血、贫血、体重减轻、厌食、食欲不振、恶心、反流和呕吐；(2)未因GC接受任何类型的化疗、放疗和手术；(3)无胃病用药史；(4)通过病理学试验明确诊断GC。从所有患者获得术后随访数据，中位随访时间为31.4个月(范围6～48个月)。除非患者的病情禁忌，本研究中接受R0切除术的Ⅱ～Ⅲ期GC患者单独接受S-1(口服氟尿嘧啶)作为术后1年的辅助化疗，其余的Ⅲ～Ⅳ期GC患者接受S-1和顺铂治疗，直到出现不良反应或证实疾病进一步发展，施用抗癌剂如伊立替康或紫杉醇。此外，选择在本院健康体检中心接受常规健康检查的22例无肿瘤健康者作为对照组。对照组与研究组的年龄和性别相匹配。研究经本院医学伦理委员会批准(批件号：201811005),所有参与者都提供了书面知情同意书。

1.2 血清总RNA提取和定量逆转录聚合酶链反应(qPCR)

将250 μL每份血清样品在冰上解冻，并以5 000 r/min离心5 min以去除细胞碎片。用5倍体积的QIAzol溶液(武汉Servicebio公司)溶解100 μL上清液。使用cDNA合成试剂盒(武汉Servicebio公司)以15 μL的总反应体积对来自血清样品的2 μL富集的RNA进行逆转录。RT产物以1∶3稀释，用作PCR模板。使用SYBR Green Supermix试剂(美国Thermo Fisher公司)以1∶5的最终稀释度通过qPCR分析互补DNA(cDNA),循环条件如下：第一步是在95 ℃下预变性30 s, 为期1个循环；第二步是在95 ℃下进行5 s、60 ℃下15 s、72 ℃下30 s的40个循环PCR反应。为每个样品建立3个重复孔，并使用2-ΔΔCT方法计算靶基因的相对表达。所用引物如下：F5(正向5′-CGTCCGAGGTGTACGA-3′,反向5′-AATCTTCCC AATCCCAGCA-3′);MTTP(正向5′-GGCAACGTG CTCACTCCAA-3′,反向5′-CACAGCCTATGTCTGCA AACT-3′);SERPINE1(正向5′-ACCAGTGGATTGTCCCAGGA-3′,反向5′-CCCAGAAGTCTGCCTAGT TTTC-3′);CYP19A1(正向5′-CCCCCGTCTCTCTGT CCG-3′,反向5′-CAGAGCCCTTTCGGTGTGTC-3′);SLC52A3(正向5′-GACTTCTGGGCGCTATACAG-3′,反向5′-CTTGAAGGCGTAGTCACA-3′);GAPDH(正向5′-GAAGGCTGGGCTCATT-3′、反向5′-CAGGAGGATTGCTGATGAT-3′)。

1.3 统计学处理

采用SPSS21.0统计软件进行数据分析。SERPINE1表达与患者的临床病理参数的相关性采用χ2检验。定量数据表示为平均值和标准差或中值和范围。使用Studentt检验(双尾)和单因素方差分析进行SERPINE1表达的统计分析比较。构建受试者工作特征(ROC)曲线并计算曲线下面积(AUC),以确定用约登指数分析OS率预测的临界值。使用Kaplan-Meier方法获得存活曲线，并使用对数秩检验进行比较。通过单变量和多变量分析(Cox比例风险回归模型)检查预后因素。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 与GC转移相关的候选血清乳酸代谢基因

在初步实验中分析的乳酸代谢相关的基因(F5、MTTP、SERPINE1、CYP19A1、SLC52A3)中，与Ⅰ期GC相比，在Ⅳ期患者的血清中SERPINE1显著上调，差异有统计学意义(P<0.001),见图1A。相反，在患有Ⅰ期和Ⅳ期GC的患者之间没有观察到血清F5和MTTP表达的显著差异，见图1B、C。

2.2 血清SERPINE1表达水平与GC恶性肿瘤的关系

研究组血清SERPINE1的表达水平显著低于对照组(P<0.000 1),见图2A。此外，SERPINE1表达水平随着肿瘤TNM分期的进展而升高(P<0.05),见图2B。基于ROC曲线分析血清SERPINE1对OS率的最大预测值(曲线下面积AUC为0.725,截断值为0.002 1),将GC患者分为高表达组(n=39)或低表达组(n=26),见图2C。表1总结了GC中SERPINE1的表达水平与临床病理特征之间的关系。与血清SERPINE1低表达组相比，血清SERPINE1高表达组静脉浸润、 T3/T4期、淋巴结转移、远处转移例数显著增加(P<0.05)。

图1血清乳酸代谢基因在Ⅰ期和Ⅳ期GC患者血清中的表达

表1 GC患者血清SERPINE1表达水平与临床病理特征之间的关系(n)

图2血清SERPINE1表达水平在Ⅰ～Ⅳ期GC患者队列中验证

2.3 血清SERPINE1表达水平预测GC患者预后

Kaplan-Meier分析显示，SERPINE1低表达的GC患者的OS率明显高于SERPINE1高表达的患者，差异有统计学意义(P<0.05),见图3。为了确定血清SERPINE1表达是否是预后的独立风险因素，使用Cox比例风险回归模型，见表2。单因素分析显示，年龄≥65岁、静脉浸润、高T分期(T3/T4期)、淋巴结转移、高TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)和血清SERPINE1高表达与OS率不良显著相关(P<0.05)。多变量分析显示，静脉浸润[危险比(HR)=3.92,95%CI:1.19～18.53,P=0.022],高T分期(HR=18.42,95%CI:2.12～157.65,P=0.008),高TNM分期(Ⅲ/Ⅳ期)(HR=23.09,95%CI:2.81～233.90,P=0.002),和血清SERPINE1高表达(HR=4.51,95%CI:1.23～23.69,P=0.021)是预测GC患者不良预后的独立风险因素。

图3根据血清SERPINE1表达水平的GC患者OS率的Kaplan-Meier曲线

表2 GC患者OS预测因素的单变量和多变量分析(Cox比例风险回归模型)

3、讨论

GC是世界范围内最常见的临床恶性肿瘤之一，发病率和病死率较高。常用的TNM分期和一些常见的生物标志物，如癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA)125、CA199和CA724,对GC患者的预后有一定的预测价值，但由于时间滞后，个体预后差异较大，逐渐不能满足目前的临床需求[4]。癌细胞的代谢特性明显不同于正常细胞，因为癌细胞即使在存在氧的情况下优先利用糖酵解而不是线粒体氧化磷酸化；这种现象被称为Warburg效应[6]。在有氧的情况下，肿瘤中较高的葡萄糖和乳酸产生率导致Warburg推测异常代谢可能是许多癌症的原因[6]。最近，越来越多的证据表明，癌细胞对有氧糖酵解的适应可能会促进癌症增殖[7]。ZHANG等[9]发现乳酸促进内皮细胞分裂，从而促进血管生成。一些研究人员已经成功构建了相应的乳酸代谢相关基因模型，用于神经胶质瘤，GC和肺腺癌的预后预测[10]。以上结果表明乳酸代谢基因用于预测GC预后的有效性和可行性。

在这项研究中，本文重点分析了GC患者血清中5个乳酸代谢相关的基因(F5、MTTP、SERPINE1、CYP19A1、SLC52A3)的表达，这些基因在先前的研究中已被证实具有致癌功能。在先前的研究中，发现F5基因在GC组织中显著上调，可能是GC的潜在预后生物标志物[11]。SERPINE1作为促肿瘤基因，其高表达与GC患者的不良预后显著相关，可作为单独诊断和预后GC的生物标志物[12]。CYP19A1被发现与肺癌和直肠癌的不良预后相关，并且是GC预后和免疫细胞浸润的潜在生物标志物[13-14]。还有研究发现MTTP的表达增加降低了晚期结直肠癌对化疗的敏感性[15]。尽管组织中表达的mRNA可以为各种类型的癌症提供准确的诊断，但收集组织样本的难度或侵袭性限制了其在检测癌症生物标志物方面的应用。组织标本的取样需要进行侵入性手术，并在初步临床分类后进行手术切除。长期以来，许多研究人员致力于建立肿瘤非侵入性诊断工具，因此该领域的主要兴趣是血清或血浆中循环的核酸。在这项研究中，本研究在一小部分血清标本中发现Ⅳ期GC患者的血清SERPINE1水平明显高于Ⅰ期患者。因此，本文选择了SERPINE1作为考察指标，并随后验证了SERPINE1是否具有作为GC转移预测生物标志物的潜力。

SERPINE1已被研究为多种癌症的潜在生物标志物，其在多种类型的癌组织中表达上调[16]。SERPINE1在前列腺癌细胞系中的异位表达可以影响增殖、凋亡和迁移[17]。此外，SERPINE1的表达促进人类三阴性乳腺癌细胞的增殖和迁移[18]。值得注意的是，最近多项研究显示SERPINE1可作为GC的诊断和预后生物标志物[12]。FENG等[19]通过GEO和TCGA数据库分析显示SERPINE1基因在GC中高表达，且与不良预后有关，并可作为一种预后生物标志物和潜在的治疗靶点。同样，XU等[20]基于TCGA-STAD数据集证实了SERPINE1可以有效预测GC患者的预后和免疫治疗反应。然而，这些研究均是基于生物信息分析获得的结论，血清SERPINE1的临床重要性还没有被研究过。因此，本研究使用来自65例GC患者和22例健康对照者的大量样本进行了独立的验证实验。这些数据为研究组血清SERPINE1水平显著高于对照组提供了有力的证据，并且Ⅳ期GC患者的血清SERPINE1水平明显高于Ⅰ～Ⅲ期GC患者。此外，血清SERPINE1的高表达水平与较差的OS相关，并作为GC患者的独立预后生物标志物。因此，本文对血清SERPINE1基因表达的研究为GC患者的非侵袭性预后和转移生物标志物提供了新的见解。

总之，本研究提供了血清乳酸代谢相关的SERPINE1基因作为GC预后的可靠生物标志物的新证据。血清SERPINE1基因高表达的GC患者有更差的OS,这强调了识别血清SERPINE1基因表达可能有助于识别具有高复发风险并需要辅助化疗和严格监测的患者。然而，作为一项回顾性研究，信息偏差是不可避免的，因此有必要在未来的临床实践中通过更具说服力的前瞻性研究来证明SERPINE1基因的临床预测价值。

基金资助:黑龙江省卫生健康委员会科研项目(H20200307B);

文章来源:孙锴,王晓东,周轶冰.乳酸代谢相关的SERPINE1基因与胃癌患者临床预后的关系[J].国际检验医学杂志,2024,45(21):2610-2614+2619.