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MYB通过调控细胞周期促进胃癌细胞的增殖

2024-12-18 191 上传者：管理员

摘要：目的探讨MYB基因在胃癌细胞增殖过程中的作用及机制。方法应用免疫组化实验在200对胃癌配对组织中检测MYB的表达；利用MTT和克隆形成实验检测MYB对胃癌细胞增殖的影响；采用流式细胞术研究MYB对细胞周期的影响；应用TCGA转录组数据分析MYB对细胞周期相关基因表达的影响。结果 MYB在胃癌组织表达显著增加，且与患者预后负相关；MYB通过调控细胞周期促进胃癌细胞的增殖，并且MYB的表达与周期素CYCLIN A2 mRNA的表达正相关。结论 MYB可作为胃癌的诊治靶点。

关键词：
MYB
人类健康
基因变异
细胞周期
胃癌
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胃癌是我国常见的高发癌种，严重危害人类健康。夏昌发团队通过开源数据比较研究，预测在2022年中国约有482万例新发癌症病例，以及321万例癌症死亡；其中，胃癌在我国男性恶性肿瘤发病率中位列第二[1]。基因变异是肿瘤发生发展的关键事件，其中最常见的基因突变有TP53(34.5%)、PIK3CA(13.5%)、LRP1B(13.1%)等[2]。为了识别胃癌发生发展过程中的关键基因，我们对168例胃癌配对组织进行了全基因组测序，发现相对于基因突变，胃癌主要以拷贝数变异为主[3]。除了MYC、ERBB2等常见的拷贝数扩增基因[4-5],我们还发现了包括MYB在内的新的拷贝数扩增基因[3]。

Behan等利用CRISPR-Cas9技术对来自30种癌症类型的324个人类癌症细胞系进行了癌症治疗的靶点筛选，发现MYB可以作为肿瘤治疗的新靶点[6]。MYB作为一个转录因子，主要是通过调控增殖和分化相关基因促进造血祖细胞的生长和分化。研究表明，在正常造血祖细胞中MYB主要通过调控CYCLIN B1促进G2/M期转化维持造血祖细胞分裂与干性，当其异常过表达时，则可过激Sox-2、Bcl-2、Bax和c-MYC等与肿瘤进展和转移相关的基因[7-11]。但目前关于该基因在实体瘤特别是胃癌中的研究较少[12-13]。在本研究中我们将检测MYB在胃癌细胞中的表达及其功能和作用机制，为胃癌的诊治提供新的思路。

1、材料与方法

1.1实验材料

1.1.1组织标本和细胞：

本研究所用组织样本均收集于北京大学肿瘤医院，并经过伦理委员会审批(批号：2018KT14)。所用人胃癌细胞系HGC-27为本实验室所有，于液氮中保存；采用质量浓度为100 g/L胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养。DMEM培养基(11995073)和FBS(16000044)均购自美国Gibco公司。

1.1.2裸鼠：

本研究所用4周龄雌性BALB/c裸鼠购自北京维通利华公司。

1.1.3引物设计与合成：

引物均由北京天一辉远公司代为合成，MYB序列如下，F:5′-GCACCAGCATCAGAAGATGA-3′,R:5′-GCAGGTTCCCAGGTACTGCT-3′;β-actin序列如下，F:5′-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′,R:5′-ACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。

1.1.4主要试剂：

柠檬酸盐修复液pH 6.0(ZLI-9064)购自中杉金桥；免疫显色试剂(GK5007)购自DAKO;FuGENE HD转染试剂(E2311)购自美国Promega; c-MYB抗体(17800-1-AP)购自美国Proteintech; MYB敲低质粒及其相应对照购自吉凯基因公司；Trizol试剂(15596018)购自美国Invitrogen;定量PCR试剂盒及EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒(AE301-02)购自中国全式金生物技术公司；MTT(M6494)购自美国Invitrogen。

1.2实验方法

1.2.1免疫组化：

将石蜡切片置于80℃烘箱2 h。二甲苯脱蜡1 h,随后用梯度酒精水化，通过高温高压修复抗原，然后加入3%过氧化氢室温孵育10 min用于阻断内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗3次，加质量浓度为50 g/L脱脂奶粉室温孵育1 h,再用PBS冲洗3次。将切片置于湿盒，加入一抗，4℃孵育过夜。次日取出，PBS冲洗后，加入适量二抗室温孵育30 min。随后去除二抗，并用PBS冲洗3次，加入二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色剂，用蒸馏水终止显色。苏木素复染，脱水封片。

1.2.2细胞转染：

转染前24 h铺皿至细胞融合度为80%左右，参照FuGENE HD说明书将干扰质粒(MYB-sh29和MYB-sh31)及对照质粒(Scramble)转入HGC-27细胞中，在37℃、体积分数为5% CO2条件下培养。48 h后在荧光显微镜下观察转染效率，并加入G418压力筛选。

1.2.3 Western blotting:

Western blotting检测HGC-27细胞MYB干扰效果。收集细胞，视细胞沉淀量多少加入SDS细胞裂解液，并以1∶100的比例加入相应的PMSF,充分混匀，而后超声蛋白，直至蛋白液变得清澈有流动性。超声结束后，12 000 r/min低温离心30 min,轻轻吸取上清；各取30μg蛋白质样品进行SDS-PAGE,然后转移到聚偏氟乙烯(polyvinglidene fluoride, PVDF)膜上。用含有质量浓度为50 g/L(w/v)脱脂奶粉的PBST室温封闭1 h,然后在4℃下与一抗孵育过夜，最后在室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h,在膜上均匀滴加显色液，并使用生物光谱凝胶成像系统进行成像。

1.2.4 RT-qPCR:

采用Trizol总RNA提取试剂进行样本RNA提取，参考EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix产品说明书进行逆转录，采用TransStart Top Green qPCR SuperMix(+DyeⅡ)进行RT-qPCR。各样品的目的基因和内参分别进行RT-qPCR反应，每个样本检测3个复孔。数据采用2-△△CT法进行分析。

1.2.5 MTT体外增殖：

采用MTT法检测MYB对胃癌细胞增殖的影响。于实验前24 h消化HGC-27细胞，离心计数，每个96孔1 000个细胞。待细胞完全贴壁后，开始添加终浓度5μg/mL的MTT,并作为第0天，4 h后吸去培养基；24 h后，继续添加新的MTT,第5天添加100μL DMSO,于水平摇床上避光摇匀30 min后，用Bio-rad680酶标仪以双波长490/630 nm检测OD值。

1.2.6克隆形成实验：

实验前24 h消化HGC-27细胞，离心计数，每60 mm皿铺500个细胞。每3 d更换或添加新鲜培养基，连续培养7～14 d后，待出现肉眼可见的小克隆后，即可以终止培养。用4%多聚甲醛固定10～30 min后，用PBS清洗2～3次。用1%结晶紫色(溶于75%乙醇)染色15～30 min,后用自来水轻轻清洗干净，而后晾干后拍照。

1.2.7裸鼠成瘤实验：

将干扰MYB表达的HGC-27细胞及其对照细胞注射于裸鼠腋窝皮下，待肿瘤最大直径超过1 cm时终止实验，剥离瘤体，并测量瘤体重量。

1.2.8细胞周期检测：

于实验前24 h消化HGC-27细胞，重新铺板活化细胞。待完全贴壁后换成无血清培养液，饥饿处理12 h、24 h将细胞收集于15 mL离心管中，1 000 r/min离心，留沉淀，并轻轻将沉淀弹散，一滴滴地加入2 mL预冷的70%乙醇，边加边摇匀，后于4℃过夜固定。次日，取出细胞，用PBS清洗2次后，去上清留沉淀，加入600μL终浓度为0.25 g/L RNase-PBS,37℃孵育30 min。用PBS于1 000 r/min离心清洗2次后，加入600μL终浓度为0.05 g/L的PI,37℃孵育30 min, 1 000 r/min离心5 min,留500μL上清重悬，而后过筛上机。

1.2.9 TCGA数据分析：

用GEPIA2数据库(https: //gepia2.cancer-pku.cn)分析TCGA胃癌样本中MYB的表达与患者预后的相关性及MYB的表达与CYCLIN A2表达的相关性。分析MYB在胃癌组织及癌旁组织的表达差异。

1.3统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。定量资料采用表示，所有数据在进行检验前进行正态分布检验。资料正态分布采用t检验或方差分析等，非正态分布资料采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 MYB在胃癌组织中高表达，且与胃癌患者预后负相关

利用免疫组化实验，我们在200对胃癌配对组织中检测了MYB的表达情况。结果显示MYB在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织[122(61.0%)vs11(5.5%),见图1A]。我们进一步分析了TCGA转录组数据，与免疫组化结果一致，MYB在胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织(见图1B),且与患者预后负相关(见图1C)。

图1 MYB高表达于胃癌组织，且与患者预后负相关

2.2 MYB促进胃癌细胞的增殖

为了研究MYB的功能，我们将干扰质粒(MYB-sh29和MYB-sh31)及对照质粒(Scramble)稳定转入高表达MYB的HGC-27细胞中。RT-qPCR和Western blotting结果显示，与对照组相比，干扰组MYB的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(见图2A～2B)。我们利用MTT细胞增殖实验和平板克隆实验检测MYB对胃癌细胞增殖能力的影响。MTT实验显示，敲低MYB表达的HGC-27细胞的增殖能力显著低于对照组(见图2C)。平板克隆形成实验显示，敲低MYB表达的HGC-27细胞形成的克隆数也显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05,见图2D)。

图2干扰MYB抑制胃癌细胞HGC-27的增殖

为了在体内研究MYB的生物学功能，我们将干扰MYB表达的HGC-27细胞及其对照细胞注射于裸鼠腋窝下，待肿瘤最大直径超过1 cm时终止实验，剥离瘤体(见图3A),并测量瘤体重量。相较于对照，干扰组细胞形成的肿瘤的体积与重量均显著减小(见图3B)。这些结果说明，MYB具有促进胃癌细胞增殖的能力。

图3干扰MYB抑制胃癌细胞HGC-27在裸鼠中的生长

2.3 MYB通过调控细胞周期促进胃癌细胞的增殖

为了阐明MYB促进肿瘤增殖的分子机制，我们利用流式细胞术分析MYB对细胞周期的影响。我们用血清饥饿法将HGC-27细胞阻止在G0期，加入血清后释放细胞周期，结果显示相较于对照组，干扰MYB表达的HGC-27细胞S期细胞数显著增加(见图4A～4B)。该结果提示，干扰MYB的表达可诱导细胞周期S期阻滞。

CYCLIN蛋白是一类在细胞周期中发挥调控作用的蛋白质。其中，CYCLIN A2主要负责细胞周期进入G2期，其表达在G2早期达到峰值。利用TCGA转录组数据，我们分析了MYB和CYCLIN A2表达的相关性，结果显示在胃癌中MYB的表达和CYCLIN A2的表达正相关(见图4C)。以上结果表明，MYB通过在转录水平调控细胞周期素CYCLIN A2的表达，进而诱导细胞周期S期阻滞。

图4干扰MYB的表达诱导细胞周期S期阻滞

3、讨论

在前期的胃癌基因组研究中，我们发现了新的拷贝数扩增基因MYB。以往研究发现MYB可以和NFIB、MYBL1、EWSR1多个基因形成融合基因促进乳腺癌等肿瘤的发生发展[14-16]。我们发现在胃癌中MYB极少发生基因融合现象，而主要以拷贝数变异为主。与拷贝数扩增一致，我们发现相对于癌旁组织，MYB显著高表达于胃癌组织。

我们的功能研究显示干扰MYB后，胃癌细胞的增殖能力显著下降。初步的机制研究发现，MYB通过调控细胞周期S期促进肿瘤细胞的增殖。细胞周期与肿瘤的关系比较密切。细胞周期主要包括细胞周期驱动机制和监管机制，当细胞周期的调控机制受到破坏时，可导致正常的细胞生长失控，从而有向肿瘤细胞转化的可能[17-18]。而肿瘤细胞也是来自于机体正常细胞，当细胞分裂增殖的不同时期受到内外因素的影响，也会导致其分化增殖出现异常，进而可导致肿瘤的发生。Cyclin A2主要负责细胞周期进入G2期，其在G2早期达到峰值。分析TCGA转录组数据，我们发现MYB与周期素CYCLIN A2的表达显著正相关，提示MYB可能通过调控CYCLIN A2的表达，影响细胞周期S期，导致细胞生长周期失控，从而诱发肿瘤。

5-氟尿嘧啶是胃癌的一线化疗药，属于S期特异性药物[19-20]。由于干扰MYB的表达可以将细胞阻滞在S期，因此我们推测靶向MYB可以增强胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。由此可见，MYB可作为胃癌诊治靶点。

文章来源:左佳欣,邢蕊.MYB通过调控细胞周期促进胃癌细胞的增殖[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(12):1605-1609.