胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率在所有恶性肿瘤中排名前列，且死亡率较高。对于消化道肿瘤的早期诊断和治疗一直是肿瘤学领域的重要研究方向，而寻找新的消化道肿瘤标志物则是治疗领域的热点。新的肿瘤表位可以为诊断和治疗提供新的途径。肿瘤标志物是特定肿瘤产生的物质，提供了识别肿瘤的靶标[1,2]。已经有多种肿瘤标志物在消化道肿瘤的诊断和治疗中得到了应用，对于肿瘤早期诊断和治疗带来了极大的好处[3,4]。血清筛选可用于寻找高亲和力的肿瘤单抗，并从中提取肿瘤抗原，从而为肿瘤早期诊断提供有力依据[5,6]。此外，这种筛选方法还有助于避免使用鼠源性单抗引发过敏反应的问题。

过继免疫治疗(adoptive immunotherapy, AIT)是肿瘤免疫治疗的重要方法之一。单链抗体(single-chain antibody fragment, scFv)以其分子量小、穿透性强、亲和力高等优势，引起人们越来越多的关注和研究。将scFv的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白与T细胞杀伤激活信号CD3ζ跨膜域，通过基因重组技术连接在基因工程表达载体上，并将其表达于杀伤性T细胞膜上形成嵌合抗原受体制备肿瘤特异性外周淋巴细胞(human periphral lymphosytals, HPL),可使T细胞不依赖MHC-I而识别肿瘤细胞，赋予T淋巴细胞靶向杀伤活性，发挥特异性杀灭肿瘤细胞的功效。本研究前期成功构建了一种新型的单链抗体。令人鼓舞的是，发现这种抗体对胃癌HGC27细胞和肝癌SMMC7721细胞具有较高的亲和力。然而，这种抗体在识别胃癌SGC7901细胞方面未能展现出相同的效果[7]。对于这种抗体研究工作的进一步完善，以及其在广泛的消化道肿瘤筛查中的可用性仍需进行大量的工作。

凋亡相关基因的表达调控在肿瘤的发生和发展中扮演着重要的角色[8,9,10]。本研究利用共刺激信号来激活T细胞，观察已制备的肿瘤特异性HPL对胃癌细胞促进 凋亡的效果，并检测对胃癌细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-x表达的影响。

1、材料与方法

1.1 材料

我们的项目保存了改造后的pCANTAB 5E-scFv噬菌体，其中包含了针对胃肠道肿瘤的单链抗体。我们购买了胃 癌细胞系HGC27和SGC7901,这些细胞经过测试发现，HGC27细胞可以被肿瘤特异性抗体识别，而SGC7901细胞则不能[7]。本研究从12名健康志愿者中采集了外周血样本。质粒提取盒购自由上海华舜生物公司，脂质体lipofectamineTM 2000来自美国Invitrogen公司。IL-2由空军军医大学基因所提供。RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司。用于实验的抗E-tag mAb购自美国Costar公司。流式细胞仪和γ计数器分别由Counter公司和安莱公司生产。酶联蛋白V-异氰硫酸荧光素(Annexin V-FITC)/PI试剂盒购自澳大利亚bender-Medsystems公司。本研究使用了 Bax、Bcl-2、Bcl-x等单克隆抗体以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体，均购自上海优宁维生物有限公司。

1.2 肿瘤特异性HPL的制备

1.2.1 重组真核表达载体scFv-CD3ζ-pcDNA3.0的构建

参照文献[11],我们采用一系列的实验步骤从健康人外周血中分离出淋巴细胞，并通过抽提总RNA的方法获取CD3ζ片段。为确保片段的准确性，我们使用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-PCR,RT-PCR)及琼脂糖凝胶电泳和基因测序等技术进行验证。然后，我们通过酶切反应及连接反应将CD3ζ片段插入重组载体scFv-pcDNA3.0中，从而最终获得重组真核表达载体scFv-CD3ζ-pcDNA3.0。

1.2.2 重组真核表达载体scFv-CD3ζ-pcDNA3.0的扩增

本研究的目标是通过扩增方法将重组真核表达载体scFv-CD3ζ-pcDNA3.0引入E.coli TG1,然后使用密度分光仪为后续工作量身定制的质粒载体提取DNA并进行定量测定。

1.2.3 PBMC细胞的分离与培养

根据文献[12]的方法，我们首先无菌抽取健康人的外周血，并使用EDTA进行抗凝。然后，我们使用Ficoli密度梯度离心法将外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)分离出来。在最后一次离心后，将细胞重悬于含有胎牛血清的RPMI 1640培养液中，并进行计数。接着，使用2 mL的RPMI 1640培养液加上10%的胎牛血清和 IL-2(工作浓度500 U/mL) 对细胞进 行重悬。最后，将细胞放入37 ℃、5%CO2的培养瓶中，在孵箱中进行培养。

1.2.4 制备肿瘤特异性HPL

使用脂质体lipofectamineTM 2000(LF-2000)作为介导剂进行细胞转染[13]。首先，按照产品说明书的指引，在12孔培养板上接种(2～6)×105/mL的PBMC细胞，并加入1 mL无血清的培养基。然后，将4 μL经稀释的无血清RPMI 1640培养液与100 μL lipofectamineTM 2000在室温下孵育5分钟。将被转染的淋巴细胞命名为肿瘤特异性HPL实验组；将转染空载体pcDNA3.0 DNA的淋巴细胞 命名为对照组。将2 μg重组载体scFv-CD3ζ-pcDNA3.0 DNA稀释在上述液体中。然后将已稀释的DNA与已稀释的LF-2000充分混合，并在室温下孵育20分钟，形成DNA-LF-2000混合物。在每孔PBMC细胞培养板中加入200 μL DNA-LF-2000混合物。在孵育6小时后进行换液，以减轻脂质 体对淋巴细胞的毒性。通过这种方式获得肿瘤特异性HPL。将空载体pcDNA3.0代替scFv-CD3ζ-pcDNA3.0用于转染，作为对照组，请参考上述方法获取转染详细步骤。

1.3 肿瘤特异性HPL对胃癌细胞凋亡的影响检测

1.3.1 肿瘤特异性HPL与胃癌细胞的共培养

本研究使用了胃癌HGC27和SGC7901细胞株，分别培养在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下传代。同时，收集肿瘤特异性HPL并计数，将其调整至每份样品数量为5×105个细胞。实验组采用4∶1比例共培养胃癌细胞HGC27和肿瘤特异性HPL。将肿瘤特异性HPL与胃癌细胞SGC7901共培养作为阴性对照，以及转染空载体pcDNA3.0的T淋巴细胞与胃癌细胞HGC27共培养作为空白对照。以上对照组均在相同条件、相同时间点和相同靶效比下进行观察。

1.3.2 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡

本研究采用了Annexin V-FITC/PI法来测定肿瘤细胞的凋亡情况。首先，收集肿瘤特异性HPL与胃癌HGC27细胞/胃癌SGC7901细胞进行共培养，比例为4∶1。在共培养48小时后，快速用PBS洗涤2次，然后进行1 000 r/min离心5分钟，并弃掉上清液。接下来，添加1×Annexin V结合溶液来制备细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液，并 取100 μL,加入5 μL的Annexin V-FITC结合物，在避光室温下孵育30分钟，然后再加入5 μL的PI溶液，在避光室温下孵育10分钟。最后，我们使用流式细胞仪进行检测，实验结果进行了3次重复，并取得了平均值。

1.3.3 免疫印迹(Western blot) 实验

在本研究中，通过将肿瘤特异性HPL与HGC27胃癌细胞或SGC7901胃癌细胞共同培养48小时，收集1×106个细胞，并经离心和裂解获得了细胞总蛋白。通过BCA法检测了各组蛋白的浓度。然后，我们取出每组50 μg蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，在使用脱脂奶粉封闭膜以防止非特异性结合后，依次使用Ⅰ抗和Ⅱ抗进行孵育。最后，使用ECL显色液进行显影，并检测细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-x和Bax的表达。在对照组中，我们将空载体淋巴细胞与HGC27和SGC7901胃癌细胞分别共同培养，在相同的培养时间和收集细胞数下，使用相同的条件和时间点进行蛋白浓度的检测、电泳、转膜和显影等步骤。而GAPDH被用作内参来标准化实验结果。

1.4 统计学方法

本研究使用了SPSS 11.0统计软件进行数据分析，计量数据用t检验来比较。检验水平设定为α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 肿瘤特异性HPL对胃癌细胞凋亡的影响

肿瘤特异性HPL与胃癌细胞HGC27、SGC7901以4∶1的比例共培养，经过48小时后，收集细胞并进行观察，以评估其对胃腺癌细胞的凋亡效应。通过Annexin V-FIFC/PI方法检测细胞凋亡。结果显示，肿瘤特异性HPL导致胃癌细胞HGC27的细胞凋亡率为(62.46±4.1)%,包括早期凋亡和 晚期凋亡，而胃癌细胞SGC7901的 凋亡率为(15.40±4.8)%。在HGC27细胞中，肿瘤特异性HPL共培养组与转染pcDNA3.0空载体的淋巴细胞对照组(16.43±3.1)%相比，差异有统计学意义(P<0.05,图1及表1)。

图1 肿瘤特异性HPL对胃癌细胞凋亡的影响   

2.2 肿瘤特异性HPL调控胃癌细胞中凋亡相关蛋白表达的检测结果

Western blot实验结果显示，在共培养48小时后，与其他对照组相比，胃癌HGC27细胞/肿瘤特异性HPL组中的Bax蛋白表达增强，而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-x的表达减弱(图2)。

表1 各组细胞凋亡率比较

图2 肿瘤特异性HPL对胃癌细胞中凋亡相关蛋白表达的影响  

3、讨论

胃癌患者的预后恢复与免疫水平密切相关。传统肿瘤疫苗注重通过提供肿瘤抗原来激活树突细胞，以促进T淋巴细胞对肿瘤产生反应。然而，直接激活淋巴细胞以提高其杀伤活性可能更为直接有效[14]。因此，我们利用具有肿瘤识别能力的单链抗体，通过基因重组构建了新型肿瘤特异性HPL,用于治疗胃癌细胞。这种方法使免疫细胞能够精确地识别和定位胃癌细胞，从而提高了免疫水平。这种做法既能将细胞免疫和体液免疫结合起来，又能间接促进抗体对肿瘤组织的特异性识别，并激活抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)。

凋亡是一种程序性细胞死亡，对于多细胞组织的稳定和新陈代谢起着至关重要的作用[15,16]。在治疗癌症时，可以使用凋亡蛋白的抑制剂来检测和评估凋亡的程度[17,18]。通过流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡信号膜联蛋白V的表达，就可以实现对肿瘤细胞凋亡效应的检测。膜联蛋白V是一种相对分子质量为35 000至36 000的钙离子依赖性磷脂结合蛋白，它能够与活细胞内的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine, PH)特异性地结合。而在凋亡过程中，磷脂酰丝氨酸则会从细胞内层翻转到细胞外。经过我们的共培养检测，我们发现肿瘤特异性HPL可以促使胃癌HGC27细胞早期凋亡和晚期凋亡。与胃癌SGC7901细胞相比，HGC27细胞的细胞凋亡率更高，这种差异在统计学上是有意义的。这些结果表明，HPL对肿瘤细胞的识别能力更易于发挥促进凋亡的作用，而对于不能识别癌靶细胞的淋巴细胞来说，它们发挥作用的能力将受到限制。实际上，一旦癌细胞被识别并发生凋亡，大部分细胞会发生溶细胞作用并产生坏死。本研究还发现，如果将转染空载体的淋巴细胞与肿瘤细胞一起培养，淋巴细胞对胃癌细胞的促凋亡作用是有限的，并不能引发大多数肿瘤细胞的早期和晚期凋亡。与胃癌细胞HGC27/肿瘤特异性HPL组相比，也存在统计学上的差异，这再次说明了HPL识别靶细胞的重要性。研究证明将单链抗体基因导入淋巴细胞可以确切地表达出单链抗体蛋白，与实验设计的构想一致。

正常细胞的凋亡是维持机体平衡和组织更新的重要过程。相比之下，肿瘤细胞的凋亡往往受到基因异常调控的影响。肿瘤细胞凋亡的发生与肿瘤患者的预后紧密相关，它在肿瘤的形成和发展中扮演着重要的角色[19],同时也影响着抗癌药物的疗效[20]。Bcl-2蛋白是一种特殊的蛋白家族[21,22],包括25种同源蛋白。其中，Bad、Bid、Bax等蛋白促进细胞凋亡，而Bcl-2、Bcl-x、Bcl-w等蛋白则抑制细胞凋亡[23]。Bax蛋白可以与Bcl-2蛋白形成异二聚体，细胞中Bcl-2/Bax的比例是决定细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素[24]。Bcl-xL蛋白是Bcl蛋白家族的一员，它在细胞中起到了抑制细胞凋亡的重要作用。Bcl-xL与Bcl-2有43%的同源性，具有与Bcl-2相同的功能，能够抑制细胞凋亡[25]。 Bcl-xL是凋亡调控中的一个重要基因，在许多恶性肿瘤中通常表达水平较高。研究发现，抑制Bcl-x蛋白可以对治疗预后产生良好的效果。此外，Bcl-x的表达水平也与肿瘤的治疗[26]对药物的反应相关[27]。

为了研究凋亡相关基因在胃癌细胞中的调控作用，我们用胃癌细胞HGC27和SGC7901分别与肿瘤特异性HPL共培养48小时，或者与转染空载体的淋巴细胞在相同条件和时间下共培养。我们检测了Bax、Bcl-2和Bcl-x蛋白的表达情况。结果显示，在与肿瘤特异性HPL共培养的HGC27细胞中，促凋亡蛋白Bax的表达增强，而Bcl-2和Bcl-x的表达减弱。这表明在肿瘤特异性HPL作用下，胃癌细胞更容易促发凋亡。

经过我们的研究发现，HPL对肿瘤细胞具有特异性的诱导凋亡作用。同时，它还能够调节胃癌细胞的凋亡相关蛋白的表达，并增强凋亡基因的表达。这种作用导致肿瘤细胞的增殖被抑制。

参考文献:

[7]徐宏勇,徐立,李开宗.一种新型胃肠道癌特异性单链抗体的表达及其在胃癌中的检测[J].胃肠病学和肝病学杂志,2011,20(8):754-757.

[11]徐立,徐宏勇,樊代明.胃肠道肿瘤靶向抗癌胚抗原单链抗体与T细胞表面受体基因的融合分子构建[J].中华消化杂志,2004,24(2):75-77.

[12]MR 格林,J 萨姆布鲁克.分子克隆实验指南[M].贺福初译.第4版.北京:科学出版社,2017:938-946.

[13]徐宏勇,徐立.一种特异性靶向性淋巴细胞对荷瘤裸鼠的治疗观察[J].中国普外基础与临床杂志,2018,25(3):283-288.

基金资助:国家自然科学基金(编号:39900068);陕西省西安市科技攻关计划项目(编号:HM1117-5);

文章来源:徐宏勇,徐立.新型肿瘤特异性HPL对胃癌细胞株凋亡信号表达的调控作用[J].现代肿瘤医学,2023,31(23):4306-4310.