全球范围内胃癌发病率和死亡率居高不下[1]。我国胃癌发病率及死亡率都位居前列[2,3]。由于胃癌易多脏器转移、且异质性强，治疗仍具有很大挑战性[4]。因此，筛选敏感及特异的生物学标志物，对改善患者预后具有重要的意义。能量代谢异常是癌症标志性特征之一[5],其中脂代谢紊乱也可通过调节癌细胞的增殖转移等生物学行为促进癌症的发生发展[6,7]。类固醇敏感性调节蛋白相关脂类转运结构域蛋白(steroidogenic acute regulatory-related lipid transfer domain containing proteins, STARD)家族是一类具有类固醇激素生成急性调节蛋白相关脂转移结构域(START结构)的蛋白质，该START结构在细胞中的各类质膜之间参与脂质的非囊泡转运。该家族包括15个STARD蛋白，分属于6个不同的亚家族，各专门运输或感知一种脂质配体[8,9,10]。近期研究表明，STARD蛋白家族成员与多种恶性肿瘤的发病与进展密切相关[11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21]。在胃癌中，蛋白磷酸酶1调节因子亚基1B(protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 1B, PPP1R1B)-STARD3嵌合融合可促进胃癌发生[21],miR-200a-3p通过下调STARD12促进胃癌进展[15]。然而，这些研究仅对其与胃癌的影响进行了相关性分析，并未深入探讨分子机制；且STARD家族其他成员是否在胃癌的发生发展中发挥作用，也尚无定论。

本研究通过人类肿瘤基因表达汇编(gene expression omnibus, GEO)和癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)等公共数据库，筛选出STARD家族中影响胃癌预后的独立因素——STARD5,分析其与临床病理特征的相关性，并探讨其分子机制，为明确STARD5预测胃癌预后的价值提供参考。

1、材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

胃癌细胞系AGS及SNU-216来自中国科学院上海细胞库上海细胞，10%胎牛血清来自以色列Biological Industries公司，RPMI 1640培养液来自美国Thermo Fisher ScientificGibco公司，STARD5 siRNA和NC siRNA由武汉金拓思生物科技有限公司设计合成，SYBR○R Premix Ex Taq试剂盒购于北京Taraka公司，β-actin、ATF4和ATF6α抗体购于美国Santa Cruz公司，AKT、Phospho-AKT(Thr308)、Integrin β1和XBP-1s抗体购于美国CST公司，二抗购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养及siRNA瞬时转染

在37℃、5% CO2、10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养。2～3 d传代培养1次，把对数生长期细胞接种到6孔板上。将Jet转染试剂4 μL、Buffer 200 μL及STARD5 siRNA或NC siRNA 6 μL混匀，静置10 min分别加入相应的孔中，培养于20% O2、5% CO2及37 ℃的培养箱中，48 h后收样。实时定量PCR检测敲减效率。STARD5 siRNA及NC siRNA序列(表1)。

表1 相关引物及序列

1.3 实时定量PCR

使用SYBR○R Premix Ex Taq法，按试剂盒说明操作，配置反应体系：Nuclease-Free Water 7.2 μL,cDNA 2 μL, 上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,Go Taq○R qPCR Master Mix 10 μL。18S为内参。引物序列见表1。

1.4 Transwell实验法

测定细胞迁移能力：下室加入500 μL含10%胎牛血清的培养基；测定细胞侵袭：50 μL 1∶30稀释后的基质胶铺在小室上，放置在5% CO2、37 ℃的孵箱中过夜。其余步骤相同：取2×104个细胞配成200 μL无血清的细胞悬液，种于上室中。孵育24 h后取出小室。用PBS冲洗，Giemsa法染色。显微镜拍照，随机选取5个视野拍照计数后进行统计学分析。

1.5 细胞黏附实验

转染STARD5 siRNA后的胃癌细胞，接种96孔板上(1×104个细胞/200 μL)。37 ℃下孵育60 min后，PBS冲掉非贴壁细胞。4%多聚甲醛固定，Wright- Giemsa法染色，显微镜观察，随机选取5个视野拍照计数后进行统计学分析。

1.6 蛋白质印迹法

预冷PBS洗2次细胞后，将其置于含蛋白酶抑制剂的裂解液中，冰上裂解5 min, 离心(12 000 r/min, r=15 cm)25 min后收集上清，考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取20 μg蛋白置于10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳2 h, 转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗后4 ℃过夜。TBST洗涤4次，10 min/次，室温下与二抗作用30 min, ECL显色后，多功能数字化图像增强化学发光系统曝光成像。

1.7 生物信息分析

1.7.1 数据筛选及处理

从GEO数据库中下载胃癌样本的数据集GSE62254作为训练集，使用函数包TCGA biolinks[22,23]从TCGA数据库中下载并处理胃癌的数据集，mRNA表达的RNASEqV2数据作为验证集。排除缺失临床特征资料的样本后从GSE62254数据集筛选出283例胃癌患者，TCGA胃癌数据集筛选出322例胃癌患者。计算出STARDs mRNA表达量的中位数，表达量≤中位数为低表达组，表达量>中位数为高表达组。

1.7.2 列线图建立

根据Cox回归分析结果，使用回归模型策略(regression model strategies, RMS)函数包绘制列线图及1、3和5年的生存率校准曲线。依据各因素对生存的影响分配权重，计分预测患者生存率，校准曲线评估性能。

1.7.3 基因集富集分析

基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA),使用R软件计算基因间的相关关系，依据Spearman相关系数排序，使用cluster profiler程序包对前1 000个和STARD5相关基因进行富集。使用GO plot程序包可视化富集结果，P≤0.05为有统计学意义。

1.8 统计学方法

使用SPSS 26.0、Graphpad Prism 8.0和R语言4.2.1进行统计学分析。危险因素分析使用Cox比例风险回归模型，以风险比(hazard ratio, HR)和95%置信区间(95% confident interval, 95%CI)评估相对风险。采用Cox比例风险单因素、多因素分析影响患者总生存期(overall survival, OS)的独立预后因素，并据此建立可视化列线图模型；以一致性指数(concordance index, C-index)评估预后模型的区分度；校准曲线比较预测情况与实际情况拟合程度，评估模型校准及预测的能力。生存分析使用Kaplan-Meier和log-rank检验，STARD5与临床病理特征的关联关系分析使用χ2检验。3组间比较用单因素方差分析，2组间比较使用Dunnett's t检验，所有数据均重复3次，并以表示。检验水准α=0.05(双尾)。

2、结果

2.1 STARD家族对胃癌患者预后的影响

STARD5、STARD7、STARD8、STARD9、STARD12和STARD13为胃癌患者OS的影响因素，P值分别为0.004、0.004、0.002、<0.001、<0.001和0.010;将这6个基因纳入多因素Cox回归分析显示，STARD12是胃癌预后的独立危险性因素，STARD5是胃癌预后的独立保护性因素，P<0.05。进一步利用TCGA胃癌数据集使用同样的方法进行验证，单因素Cox回归分析结果显示STARD5、STARD8和STARD12为胃癌患者OS的影响因素，P值分别为0.035、0.001和0.088;多因素Cox回归分析结果提示，STARD8为胃癌患者的独立危险因素，STARD5为胃癌患者的独立保护因素，P<0.05。见表2。

2.2 基于STARD5表达和临床病理学特征及胃癌预后模型的构建

STARD5、T、N及M分期均为胃癌患者独立预后因素，均P<0.05。为简便快捷准确地预测胃癌患者的生存率，利用上述GSE62254数据集中筛选出的独立预后因素绘制了列线图，该模型C-index和95%CI为0.701(0.659～0.744)。进一步通过重复Bootstrap自抽样1 000次对该模型进行内部验证，将Bootstrap抽样预测生存率作为横坐标、实际生存率作为纵坐标绘制1、3和5年的校准曲线均与对角线拟合较佳，提示此预测模型预测胃癌患者预后的能力较佳。见表3和图1。

2.3 STARD5表达水平和临床病理特征的关系

女性高表达STARD5的比例高于男性(58.2% vs 45.4%,P=0.041)。进一步使用χ2检验分析STARD5高、低表达组与不同部位转移间的关系发现，无肝转移的样本高表达STARD5的比例高于有肝转移的样本(52.4% vs 31.4%,P=0.020),提示STARD5低表达可能通过促进胃癌肝转移而引起预后不良。见表4和表5。

表2 GSE62254及TCGA数据集STARD家族的多因素Cox回归分析结果

表3 GSE62254数据集中STARD5与临床病理学参数的Cox回归分析

图1 胃癌患者生存分析   

2.4 STARD5影响胃癌细胞的转移能力

为验证STARD5对胃癌细胞转移能力的影响，利用siRNA在AGS和SNU-216胃癌细胞中瞬时沉默STARD5的表达。进一步通过Transwell迁移实验、Matrigel侵袭实验及细胞黏附实验发现，沉默STARD5后胃癌细胞的迁移及侵袭能力增加，对细胞外基质的黏附能力增强，提示STARD5可抑制胃癌细胞的转移。见图2和表6。

表4 GSE62254数据集中STARD5表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.5 STARD5对PI3K/AKT通路及Integrin β1的影响

STARD5低表达与Focal adhesion、PI3K/AKT等通路相关。提示STARD5低表达可能激活了这些通路从而促进胃癌细胞转移。随后为明确STARD5对Focal adhesion及PI3K/AKT通路中Integrinβ1及 AKT磷酸化的影响，敲减STARD5后，Integrin β1表达水平升高， AKT磷酸化水平升高，提示 STARD5 可抑制Integrinβ1的表达及PI3K/AKT通路的活化。见图3。

表5 GSE62254数据集中STARD5表达与转移部位的关系[n(%)]

2.6 敲减 STARD5的影响

敲减STARD5后，内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress, ERS)通路中的关键转录因子剪接形式的X盒结合蛋白1(spliced X-box binding protein 1, XBP-1s)、激活转录因子4(activating transcription factor 4, ATF4)、激活转录因子6α(activating transcription factor 6α, ATF6α)表达水平升高。提示 STARD5 的下调可诱导ERS。见图4。

2.7 结合位点预测结果

7个ERS相关基因可调控Integrin β1表达，其中包含了ERS中的经典转录因子XBP-1。结合位点预测结果显示，XBP-1与Integrin β1启动子区域存在6个结合位点，提示XBP-1可促进Integrinβ1的转录表达。见图5。

3、讨论

本研究发现，STARD5是胃癌预后的独立保护因素，其低表达与肝转移密切相关。推测STARD5低表达可能通过激活XBP-1促进Integrin β1转录表达并激活PI3K/AKT信号通路来促进胃癌细胞转移。

STARD5属于类固醇生成急性调节性脂质转移结构域蛋白STARD4亚家族，几乎全部由START结构域构成，主要作用是结合并转运胆固醇、25-羟胆固醇、胆汁酸。STARD5主要在免疫细胞(巨噬细胞)、肝细胞、肾脏细胞中表达；内质网上游离胆固醇增多后引起内质网应激反应，STARD5可将多余胆固醇转运离开内质网[24]。STARD5在肝癌中可能发挥抑癌作用，其在肝癌中低表达，并提示了更差的预后[25]。还有报道发现，STARD5的DNA 高甲基化与肾透明细胞癌(kidney clear cell carcinoma, KIRC)患者的不良预后密切相关，对KIRC的诊断也具有较高的准确性[26]。在多类型恶性肿瘤中STARD5可能作为一个恶性肿瘤预后的保护因素，抑制了恶性肿瘤的发生发展，STARD5低表达通常导致预后不良。本研究发现，STARD5低表达组的OS明显短于STARD5高表达组；STARD5低表达时，其肝转移的发生率也明显升高；敲减胃癌细胞中的STARD5后，其迁移、侵袭及黏附的能力明显增强。因此，胃癌细胞中STARD5低表达可能通过促进胃癌肝转移而导致预后不良，也提示了STARD5可能成为预测胃癌预后的生物标志物。

图2 STARD5对胃癌细胞的影响（×200) 

表6 3个小室视野中AGS和SNU-216胃癌细胞计数

本研究显示，STARD5低表达与Focal adhesion、PI3K-AKT信号通路等通路密切相关。有研究报道，Focal adhesion信号通路在肿瘤转移中发挥重要作用[27,28]。其中出现大量Integrin蛋白家族，而Integrin β1可与其他亚基结合形成异源二聚体发挥重要作用[29,30],并且在Integrin下游的PI3K/AKT通路中也存在Integrin β1。敲减胃癌细胞中STARD5后证实，Integrin β1表达水平和AKT磷酸化水平升高。有研究发现，STARD5在巨噬细胞中结合转运内质网上多余的游离胆固醇，敲减STARD5将诱发ERS[24]。本研究敲减胃癌细胞中的STARD5后证实，XBP-1s、ATF4、ATF6α表达水平升高；进一步将ERS通路基因列表及Integrin β1上游转录因子列表取交集发现， ERS通路中经典转录因子XBP-1是Integrinβ1转录因子之一，利用UCSC Genome Browser预测发现XBP-1与Integrin β1启动子区域存在6个结合位点，提示了STARD5表达水平降低可能通过XBP-1促进了Integrin β1的转录表达。

图3 沉默STARD5对SNU-216细胞内Integrinβ1及PI3K/AKT通路相关蛋白表达的影响  

图4 沉默STARD5对SNU-216细胞内内质网应激通路相关蛋白表达的影响  

图5 内质网应激与Integrinβ1的关系  

综上所述，STARD5低表达可能是通过激活XBP-1上调Integrin β1蛋白表达，进而激活PI3K/AKT信号通路来促进胃癌细胞转移。本研究揭示了STARD5抑制胃癌发生发展的新作用机制，对明确STARD5成为胃癌预后标志物和治疗靶点提供了可能性。然而，由于本研究是基于GEO在线数据库，无法完全代表胃癌中STARD5蛋白表达情况，后续应扩大样本量并结合免疫组化等方法，进一步地明确STARD5作为胃癌预后标志物的可能性。此外，由于STARD5与胆固醇及脂代谢密切相关，需进一步探索STARD5影响胃癌转移的调控机制。

参考文献:

[3]郑荣寿,张思维,孙可欣,等.2016年中国恶性肿瘤流行情况分析[J].中华肿瘤杂志,2023,45(3):212-220.

基金资助:国家自然科学基金(32170791);

文章来源:谢蕊西,吴歆姝,包博文等.STARD5对胃癌的预后影响及机制研究[J].中华肿瘤防治杂志,2024,31(01):19-26.