骨肉瘤(osteosarcoma, OS)是儿童及青少年常见的肉瘤[1],具有较高的转移与复发风险[2,3,4],尽管其疗效取得了很大的进展[5],但骨肉瘤患者的总体生存率仍不理想[6,7],研究骨肉瘤进展的分子机制将有助于明确其潜在的治疗靶点。Hippo信号通路在多种物种中调节组织稳态[8],SOX2和MYC是其下游的转录因子[9]。本研究发现锌指MIZ型含1反义RNA 1(zinc finger MIZ-type containing 1 antisense RNA 1, ZMIZ1-AS1)是一种可以被SOX2和MYC转录调控的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA);同时研究表明lncRNA可以募集RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBP)稳定mRNA[10,11,12],其中PTBP1能促进骨肉瘤进展[13,14]。本研究探讨了ZMIZ1-AS1在骨肉瘤发展过程中的潜在作用机制，旨在探索有前景的治疗方案。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞

SPF 级健康雄性Sprague-Dawley大鼠51只，8周龄，体质量220～250 g, 购自武汉大学动物实验中心，动物饲养于我院实验中心动物房。实验大鼠的模型操作及取材过程均获得我院实验动物伦理委员 会批准。两种骨肉瘤细胞系 (U-2OS与SAOS2)及人成骨细胞系hFOB1.19均购自美国的ATCC。

1.1.2 主要试剂与仪器

阴性对照shRNA购自中国 上海吉玛制药技术公司； PTBP1与ZMIZ1过表达载体、空pcDNA3.1载体、NanoDrop微量分光光度计、PrimeScript RT试剂试剂盒均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；LipofectamineTM 2000转染试剂、TRIzol试剂、胎牛血清、DMEM试剂均购自美国Gibco公司；Power SYBR Green预混液购自美国Life Technology公司；CCK-8试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；含有ZMIZ1-AS1启动子的报告质粒购自上海吉凯基因医学科技公司；双荧光素酶报告检测系统购自美国Promega公司；EZ-ChIPTM试剂盒购自美国Millipore公司；抗MYC(ab32072)、抗PTBP1(ab133734)、抗ZMIZ1(ab113294)及抗GAPDH(ab8245)抗体均购自英国Abcam公司；RIPA裂解缓冲液购自北京宝日医生物技术公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生物信息学分析

根据hTFtarget在线工具(http: //bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget#!/)预测可被转录因子SOX2和MYC调控的lncRNA。GEPIA数据库(http: //gepia2.cancer-pku.cn/)预测ZMIZ1-AS1与ZMIZ1在肉瘤组织中表达的相关性。starBase在线工具检索可以同时结合ZMIZ1-AS1与ZMIZ1的蛋白[15]。UCSC Xena数据库(https: //xenabrowser.net/datapages/?cohort=GDC%20TARGET-OS&removeHub=https%3A%2F%2Fxena.treehouse.gi.ucsc.edu%3A443)下载骨肉瘤样本转录组信息，以Spearman相关性分析预测ZMIZ1与ZMIZ1-AS1表达的相关性。

1.2.2 细胞培养

所有细胞均在37 ℃、5%CO2的条件下培育于含10%胎牛血清及1%青霉素及链霉素双抗的DMEM培养基中。

1.2.3 细胞转染

使用含抗ZMIZ1-AS1短发夹RNA的质粒 (sh-ZMIZ1-AS1#1/2)、SOX2(sh-SOX2#1/2)、MYC(sh-MYC#1/2)、PTBP1(sh-PTBP1)与阴性对照shRNA(sh-NC)。使用LipofectamineTM 2000转染试剂将质粒转染到SAOS2和U-2OS细胞中。

1.2.4 RT-qPCR

使用TRIzol试剂从U-2OS与SAOS2细胞中提取总RNA。RNA质量以NanoDrop微量分光光度计测定。使用PrimeScript RT试剂试剂盒将总RNA反转录为环状DNA(circular DNA,cDNA)。使用Power SYBR Green预混液进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)。相对基因表达量采用2-ΔΔCT方法[16]计算，以GAPDH作为内参对照。热循环条件为94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共26次循环。

1.2.5 细胞活力与增殖检测

将SAOS2和U-2OS细胞以2×104个细胞/孔的浓度分别接种于6孔板上1 d、2 d、3 d, 在黑暗中将10 μL CCK-8加入每孔中2 h, 以450 nm吸光度测定其活力。将细胞置入6孔板中进行下一步的集落形成试验。2周后，细胞固定后用结晶紫染色液染色，计算细胞形成的集落(≥50)。

1.2.6 Transwell细胞侵袭试验

以50 ng/mL的基质胶预涂Transwell腔以评估细胞侵袭能力。将转染的SAOS2和U-2OS细胞置于含100 μL无血清培养液的上腔室中，底腔中加入含10%胎牛血清的生长培养基500 μL,培养24 h后用0.1%结晶紫染色液染色后置于显微镜下观察。

1.2.7 划痕实验

无血清培养基中已转染的SAOS2与U-2OS细胞分别置于6孔板中，在细胞达到80%～90%汇合后以200 μL的无菌移液管头在其表面制造划痕。PBS处理两次后去除非贴壁细胞，随后观察划痕区域，并在划痕后0 h和24 h用倒置显微镜拍照。

1.2.8 双荧光素酶报告实验

使用LipofectamineTM 2000转染试剂将SAOS2和U-2OS细胞与shRNA及含有ZMIZ1-AS1启动子的报告质粒共转染到骨肉瘤细胞中。相对荧光素酶活性在双荧光素酶报告检测系统上检测，使用Renilla荧光素酶作为内参以排除对转染效率的影响。通过比较sh-SOX2或sh-MYC转染细胞与sh-NC转染细胞中含有ZMIZ1-AS1启动子的报告基因相对荧光素酶活性来检测沉默SOX2或沉默MYC后对ZMIZ1-AS1启动子的影响。

1.2.9 染色质免疫沉淀实验

使用EZ-ChIPTM试剂盒进行染色质免疫沉淀试验(chromatin immunoprecipitation, ChIP)检测SOX2及MYC蛋白与ZMIZ1-AS1启动子的结合。使用抗SOX2、抗IgG及抗MYC抗体进行免疫沉淀。ChIP DNA样本被沉淀、洗涤、干燥并在细胞生物学毒物水中重悬。RT-qPCR检测ZMIZ1-AS1启动子的富集情况。

1.2.10 Western blotting

用10%SDS-PAGE提取总蛋白并转移到PVDF上，用PBS清洗后以5%脱脂牛奶堵塞膜，并在4 ℃下用特异性一抗孵育一晚。随后将膜 与二抗在室温下孵育2 h。最终， 蛋白信号通过PierceTM ECL底物进行可视化。使用的一抗为：抗SOX2(ab92494)、抗MYC(ab32072)、抗PTBP1(ab133734)、抗ZMIZ1(ab113294)和抗GAPDH(ab8245),内部对照使用GAPDH。

1.2.11 RNA免疫沉淀实验

SAOS2和U-2OS细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解，并用磁珠和PTBP1抗体或IgG抗体孵育。用TRIzol提取RNA样本，RT-qPCR检测由抗PTBP1富集沉淀的ZMIZ1-AS1或ZMIZ1。

1.2.12 动物实验

使用随机数字表法将裸鼠分为三组：sh-NC组、sh-ZMIZ1-AS1组及sh-ZMIZ1-AS1+ZMIZ1组，每组各17只。各组裸鼠分别注射1×106个骨肉瘤细胞，注射28 d后对小鼠实施安乐死，完整切除肿瘤并称重、拍照记录。

1.3 统计学方法

定量变量表示为三个生物学重复序列的平均值±标准差，两组之间或多组之间的比较使用t检验或单因素方差分析，然后进行图基检验。数据采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 8软件进行统计分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 SOX2、MYC和 ZMIZ1-AS1在骨肉瘤细胞中 表达增高

SOX2和MYC在SAOS2和U-2OS细胞中的表达水平高于hFOB 1.19细胞。hTFtarget工具共识别出21个靶点，其中包括6个lncRNA(ZMIZ1-AS1、CTD-3252C9.2、AC007880.1、FLJ37453、DARS-AS1和RP11-83B20.1)。本研究在SAOS2、U-2OS与hFOB1.19细胞中检测了上述lncRNA的表达，结果发现上述靶点中仅有ZMIZ1-AS1在SOX2和U-2OS细胞中的表达高于hFOB1.19细胞(图1)。

图1 SOX2、MYC及ZMIZ1-AS1在不同细胞中的表达  

2.2 SOX2和MYC通过转录激活ZMIZ1-AS1

sh-SOX2和sh-MYC转染可降低SOX2和MYC的mRNA与蛋白表达(图2A-B)。在sh-SOX2#1/2或sh-MYC# 1/2转染的SAOS2与U-2OS细胞中ZMIZ1-AS1的表达下调(图2C)。含有ZMIZ1-AS1启动子序列的报告载体的荧光素酶活性被SOX2和MYC敲除抑制(图2D)。此外，ChIP检测结果表明SOX2和MYC蛋白都与ZMIZ1-AS1启动子结合(图2E)。

图2 SOX2和MYC通过转录激活ZMIZ1-AS1  

2.3 沉默ZMIZ1-AS1可抑制骨肉瘤细胞的活力、增殖、迁移与侵袭

为了确定ZMIZ1-AS1在骨肉瘤细胞中的功能，应用抗ZMIZ1-AS1的shRNAs(sh- ZMIZ1-AS1#1/2)敲除ZMIZ1-AS1,并通过RT-qPCR验证 敲除效率(图3A)。下调ZMIZ1-AS1的表达后，骨肉瘤细胞的活力、增殖、迁移和侵袭能力明显受到抑制(图3B-C)。

图3 沉默ZMIZ1-AS1可抑制骨肉瘤细胞的活力、增殖、迁移与侵袭   

根据GEPIA数据库预测，ZMIZ1-AS1与ZMIZ1在肉瘤组织中的表达水平呈正相关，同时通过UCSC Xena数据库预测发现ZMIZ1-AS1在骨肉瘤组织中的表达与ZMIZ1的表 达呈正相关(图4A)。敲低ZMIZ1-AS1可 降低SAOS2和U-2OS细胞中ZMIZ1 mRNA表达与蛋白水平(图4B)。

2.5 ZMIZ1-AS1募集PTBP1蛋白稳定ZMIZ1 mRNA

RNA免疫沉淀实验显示lncRNA ZMIZ1-AS1和ZMIZ1 mRNA均被PTBP1抗体显著沉淀(图5A)。然而，敲除ZMIZ1-AS1基因降低了ZMIZ1 mRNA与PTBP1蛋白的结合(图5B)。敲除ZMIZ1-AS1对PTBP1 mRNA表达及翻译无显著影响(图5C)。RT-qPCR和蛋白免疫印迹结果验证了PTBP1的干扰效果(图5D)。敲除PTBP1将抑制ZMIZ1 mRNA的表达及翻译(图5E)。

图4 ZMIZ1-AS1正向调控ZMIZ1的表达   

图5 ZMIZ1-AS1募集PTBP1蛋白稳定ZMIZ1 mRNA   

2.6 ZMIZ1-AS1通过稳定ZMIZ1促进骨肉瘤细胞的活力、增殖、迁移及侵袭

通过挽救实验确认ZMIZ1-AS1、PTBP1和ZMIZ1之间的调控途径，ZMIZ1及PTBP1过表达挽救了ZMIZ1-AS1敲除对骨肉瘤细胞活力、 增殖、迁移及侵袭的抑制作用 (图6A-C)。

2.7 ZMIZ1-AS1通过稳定ZMIZ1促进骨肉瘤细胞在裸鼠体内生长

动物实验中，sh-ZMIZ1-AS1组与sh-NC组相比，ZMIZ1-AS1和ZMIZ1表达均较低，ZMIZ1在sh-ZMIZ1-AS1+ZMIZ1组的表达高于sh-ZMIZ1-AS1组(图7A)。与sh-NC组相比，沉默ZMIZ1-AS1抑制了小鼠的骨肉瘤生长，而过表达ZMIZ1可以恢复ZMIZ1-AS1表达下调对肿瘤生长的抑制作用(图7B)。

图6 ZMIZ1-AS1通过稳定ZMIZ1促进骨肉瘤细胞的活力、增殖、迁移及侵袭  

3、讨论

Hippo信号通路与多数人类恶性肿瘤的发生发展密切相关[17],当Hippo通路失活时，去磷酸化的YAP/TAZ被转位到细胞核中，并与TEAD家族及其他的转录因子结合激活基因转录[18],这种基因表达的改变会协同促进肿瘤的发生[19]。此外，大量研究表明lncRNA表达水平的变化与骨肉瘤的进展密切相关[20,21,22],其中lncRNA ZMIZ1-AS1调控异常与恶性肿瘤的发生有关[23,24]。lncRNA通过Hippo信号通路参与了包括骨肉瘤在内的许多恶性肿瘤的进展，如ZHOU等人[25]发现lncRNA TANK1反义寡核苷酸通过Hippo/YAP通路抑制骨肉瘤细胞生长和干细胞特性。然而ZMIZ1-AS1如何通过Hippo通路影响骨肉瘤发生与进展的潜在作用机制尚未被报道。本研究揭示了ZMIZ1-AS1在骨肉瘤细胞中高度表达，沉默ZMIZ1-AS1可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，表明ZMIZ1-AS1的高表达可能与骨肉瘤进展正相关。

图7 ZMIZ1-AS1通过稳定ZMIZ1促进骨肉瘤细胞在裸鼠体内生长   

既往研究发现lncRNA,如MIR100HG[26]、TANK1-ASODN[25]和circTADA2A[27]可通过Hippo通路调控骨肉瘤进展，本研究通过RT-qPCR和Western blotting实验揭示了Hippo信号通路下游转录因子SOX2与MYC能通过转录来激活ZMIZ1-AS1。lncRNAs基因座在顺式中发挥调节其相邻编码基因表达水平的作用[28],lncRNAs与整个基因组中相邻的转录因子相关，例如GATA6-AS1与GATA6、PTV1与MYC、LINC00261与FOXA2[29]等。值得注意的是，天然反义转录物通过调节其正义基因的表达在各种细胞过程中发挥重要作用[30],本研究发现ZMIZ1在骨肉瘤细胞中表达较高，同时GEPIA数据库预测肉瘤组织中ZMIZ1-AS1与ZMIZ1的表达呈正相关；另外本研究检测了SAOS2与U-2OS细胞中ZMIZ1-AS1对其同源意义转录本ZMIZ1的影响，结果表明ZMIZ1-AS1能正向调控ZMIZ1的表达。

lncRNA可以与RBP相互作用稳定mRNA[12],PTBP1是稳定KH型剪接调节蛋白的RBP,能促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭[14]。我们发现PTBP1蛋白能同时与ZMIZ1-AS1及ZMIZ1结合，ZMIZ1-AS1能与PTBP1蛋白相互作用稳定骨肉瘤细胞中的ZMIZ1,同时ZMIZ1-AS1对PTBP1的表达无调控作用，而下调PTBP1会降低ZMIZ1的稳定性；此外，敲除ZMIZ1-AS1抑制了PTBP1蛋白与ZMIZ1 mRNA的结合能力。综上所述，ZMIZ1-AS1通过招募骨肉瘤细胞中的PTBP1蛋白来稳定ZMIZ1,沉默PTBP1后ZMIZ1稳定性降低从而抑制了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而这种作用被ZMIZ1所挽救，即过表达PTBP1或ZMIZ1可挽救下调ZMIZ1-AS1对骨肉瘤细胞生物学过程的抑制作用。最终，本研究构建了裸鼠异种移植瘤模型，发现沉默 ZMIZ1-AS1能通过ZMIZ1抑制骨肉瘤在动物体内生长。

总之，本研究探讨了ZMIZ1-AS1在骨肉瘤中的生物学功能与分子机制，发现ZMIZ1-AS1通过招募PTBP1蛋白稳定ZMIZ1以促进骨肉瘤生长。相邻编码基因的激活是ZMIZ1-AS1发挥作用的重要机制，该发现可能为骨肉瘤患者的靶向治疗提供新思路。然而本研究仅是ZMIZ1-AS1对骨肉瘤发生、进展作用机制的初步探索，其他生物学机制仍待进一步研究。

参考文献:

[3]张丹,周逸驰.内质网应激相关基因能预测骨肉瘤预后并与肿瘤免疫微环境相关[J].生物信息学,2023,21(4):247-262.

[17]吉新彦,钟国轩,赵斌.哺乳动物Hippo信号通路分子机制研究进展[J].遗传,2017,39(7):546-567.

[22]廖迎锋.lncRNA RHPN1-AS1靶向miR-485-5p调控骨肉瘤细胞增殖､凋亡､迁移､侵袭及其分子机制[J].现代肿瘤医学,2021,29(20):3544-3552.

基金资助:职业病危害识别与控制湖北省重点实验室开放基金项目(编号:OHIC2020Z12);湖北省武汉市卫健委医学科研面上项目(编号:WX21D83);

文章来源:周逸驰,黎清波,蔡磊等.lncRNA ZMIZ1-AS1通过稳定ZMIZ1促进骨肉瘤进展[J].现代肿瘤医学,2024,32(03):412-419.