铜绿假单胞防疫菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种常见的条件致病革兰阴性菌，多发于院内重症监护病房，可引起术口感染，慢性呼吸道感染等疾病[1]。近年来抗生素的滥用使PA对头孢菌素，多粘菌素和磺胺类药物产生广泛耐药性，加大了临床抗感染治疗难度[2]。PA的耐药机制有产金属β-内酰胺酶、作用靶点突变、膜孔蛋白的改变以及主动外排系统[3,4]。其中外排泵是其多重耐药和泛耐药的物质基础，介导天然耐药和获得性耐药，4种外排泵基因mexAB-OprM,mexCD-OprJ,mexEF-OprN,mexXY-OprM mRNA在临床耐药菌株中高表达最为常见[5]。耐药菌利用主动外排系统，将进入体内的抗生素泵出体外，减少体内药物浓度降低疗效[6]。外排泵抑制剂苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺（phe-Arg-β-naphthylamide,PAβN）能破坏细菌主动外排系统，恢复其对药物的敏感性[7]。

近年来国内外学者逐渐重视中药抗菌，研究证实中药具有多途径抑菌的优势，在抗耐药菌方面也有一定的效果。中药单体化合物在抑制β-内酰胺酶、代谢活动相关酶、外排泵、细菌菌膜、改变细胞膜通透性、消除耐药质粒方面具有一定的效果[8]。痰热清注射液是由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘组成的现代中药制剂，具有清热解毒，化痰止咳之功效[9]。前期的研究发现痰热清注射液对革兰氏阳性菌有抑制作用，能破坏耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌生物膜的三维结构，为临床治疗耐药菌生物膜提供参考[10]，对革兰氏阴性菌也具有抑制作用，与亚胺培南西司他丁联合影响浮游和生物膜状态铜绿假单胞菌的正常生长[11]。本研究主要从耐药菌主动外排系统的角度，在临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌中筛选出外排泵高表达的阳性菌株，探讨痰热清注射液与临床常用抗生素的相互作用和对多重耐药铜绿假单胞菌外排泵的体外抑菌作用，降低抗生素临床使用剂量，且痰热清连续作用细菌，为研究体内抗革兰阴性耐药菌的实验提供可能性。

1、 材料

1.1菌株

3株多重耐药铜绿假单胞菌（multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa,MDR-PA)1508032,1608016,1708116分离自北京市东直门医院住院患者送检的痰液标本，野生型铜绿假单胞菌PAO1由中国科学院北京微生物研究所未庆教授惠赠。

1.2试剂

PAβN（美国Sigma公司，批号P4157）；头孢他啶药敏纸片（CAZ)30μg（批号21028），头孢哌酮药敏纸片（CFP)75μg（批号21026），头孢哌酮/舒巴坦药敏纸片（CFP/SU)75/30μg（批号21065），美罗培南药敏纸片（MPN)10μg（批号21075），氨曲南药敏纸片（AZT)30μg（批号21056），阿洛西林药敏纸片（AZL)75μg（批号21049），均购自北京天坛药物生物技术开发公司；胰蛋白胨，酵母提取物（英国Oxoid公司，批号分别为1863590,1390139-02）；痰热清注射液（TRQ，上海凯宝药业股份有限公司，批号1704117）；氯化钠，琼脂粉，trizol，三氯甲烷，异丙醇，乙醇（国药集团化学试剂北京有限公司，批号分别为20180509,10000561,XW24402241,10006818,40064360,80176961);5×TRUE RT Master Mix（美国Bimake公司，批号B24403);2×SyBr Green实时荧光定量聚合酶链式反应（Realtime PCR)Mix（北京艾德莱生物科技有限公司，批号B21202）。

1.3仪器

SW-CJ-1FD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；THZ-D型恒温振荡培养箱（苏州培英实验设备有限公司）；KBF-240型恒温恒湿培养箱（上海森信实验仪器有限公司）；OSE-MC8型离心机[天根生化科技（北京）有限公司]；V-1100型可见光分光光度计（上海美普达仪器有限公司）；770006型高压灭菌锅（日本Sanyo公司）；StepOnePlus型Real-time PCR仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

2、 方法

2.1药敏实验

分别挑取细菌单菌落接种于LB液体培养基3 mL,37℃280 r·min-1增菌至对数期，稀释菌液在600 nm处的吸光度A达到0.02，采用倍比稀释法，CAZ由1 024 mg·L-1稀释至2 mg·L-1;CFP由4 096 mg·L-1稀释至8 mg·L-1;CFP/SU由2 048 mg·L-1稀释至4 mg·L-1;TRQ由16 500 mg·L-1稀释至33 mg·L-1,37℃80%恒温恒湿培养24 h。根据2017年美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准判定结果。

2.2外排泵阳性菌株的筛选

2.2.1 K-B法筛选外排泵阳性菌株

制备添加PAβN（终质量浓度50 mg·L-1）的LB平板[12]，以LB平板为对照，利用纸片扩散法检测MDR-PA对CAZ,CFP,CFP/SU,MPN,AZT,AZL药敏纸片抑菌环直径。挑取待测菌落接种于LB液体培养基3 mL,37℃280 r·min-1增菌至对数期，稀释菌液在600 nm处的A达到0.1，均匀涂布于平板，贴上相应的药敏纸片，37℃培养24 h，根据2017年CLSI标准判定结果。

2.2.2 Real-timePCR检测外排泵阳性菌株相关基因表达水平

以PAOl为对照，MDR-PA外排泵基因mexAB,mexCD,mexEF,mexXY中至少有1个的表达水平是PAOl的2倍或2倍以上，即为外排泵表型阳性菌株。挑取外排泵阳性菌株至3 mL LB液体培养基中，37℃280 r·min-1增菌至对数期，12 000 r·min-1离心5 min收集菌体，trizol法提取RNA，经三氯甲烷，异丙醇，乙醇提纯，260/280法测定总RNA丰度。根据5×TRUE RT Master Mix试剂盒说明书逆转录为cDNA，采用2×SYBR Green Real-time PCR Mix染料法定量检测mexAB,mexCD,mexEF,mexXY mRNA表达量，以rpoD为内参基因。Real-time PCR条件为95℃预变性5 min,95℃变性15 s,60℃退火延伸30 s，循环40次。计算每个样本基因的3个复孔的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算目的mRNA相对表达量。引物由北京中美泰和有限公司合成。引物序列见表1。

2.3 TRQ对MDR-PA外排泵阳性菌株的作用

2.3.1联合用药对MDR-PA外排泵的影响

制备添加TRQ（终质量浓度3 g·L-1）的LB平板[13]，利用纸片扩散法检测CAZ,CFP,CFP/SU,MPN,AZT,AZL药敏纸片对MDR-PA外排泵阳性菌株的抑菌环直径。挑取待测菌落接种于3 mL LB液体培养基，37℃280 r·min-1增菌至对数期，稀释菌液在600 nm处的A达到0.1，均匀涂布于平板，贴上相应的药敏纸片，37℃培养24 h，测定抑菌圈直径，以仅加TRQ的LB平板为对照，测定添加TRQ前后抑菌圈大小的变化即为各组抑菌环差值。通过纸片扩散法检测TRQ对抑菌环直径大小的改变，来判断TRQ与抗生素的作用关系，当抑菌环直径差值大于零时，表明中药与抗生素的作用为协同作用。

表1外排泵基因引物序列

2.3.2 TRQ对MDR-PA外排泵基因表达的影响

用TRQ和CAZ,CFP,CFP/SU亚抑菌浓度分别与菌液等体积共培养16～18 h,12 000 r·min-1离心5 min收集菌体，另设空白组，trizol法提取RNA，经三氯甲烷，异丙醇，乙醇提纯，260/280法测定总RNA丰度。根据5×TRUE RT Master Mix试剂盒说明书逆转录为cDNA，采用2×SYBR Green Realtime PCR Mix染料法定量检测mex-AB,mex-CD,mex-EF,mex-XY mRNA表达量，以rpoD为内参基因。Real-time PCR条件为95℃预变性5 min,95℃变性15 s,60℃退火延伸30 s，循环40次。计算样本基因的3个复孔的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算目的mRNA相对表达量。

2.3.3 TRQ诱导MDR-PA后药物敏感性变化测定

将MDR-PA外排泵阳性菌菌液与TRQ等体积共培养6次，记为R6，空白组记为R0。利用纸片扩散法检测CAZ,CFP,CFP/SU,MPN,AZT,AZL药敏纸片对TRQ持续作用后细菌的抑菌环直径。挑取待测菌落接种于3 mL LB液体培养基，37℃280 r·min-1增菌至对数期，稀释菌液在600 nm处的A达到0.1，均匀涂布于平板，贴上相应的药敏纸片，37℃培养24 h，测定抑菌圈直径。

2.4统计学分析

采用Graphpad 8统计软件进行数据分析，计量资料用xˉ±s表示，组间比较采用方差分析，呈正态分布，P<0.05为差异有统计学意义。

3、 结果

3.1 MDR-PA的鉴定

采用微量肉汤稀释法检测菌株对药物的敏感性，根据2017年CLSI判断标准，MIC折点≤8 mg·L-1为敏感菌，MIC折点在16 mg·L-1时为中介，MIC折点≥32 mg·L-1为耐药菌，即3株均为MDR-PA。见表2。

表2 3株细菌对抗生素的MIC分布情况

3.2 MDR-PA外排泵阳性菌株的筛选

3.2.1 K-B法筛选MDR-PA外排泵表型阳性菌株

添加外排泵抑制剂PAβN(50 mg·L-1）后，AZT对菌株1508032的抑菌圈直径明显增大（P<0.05),CFP/SU,MPN对菌株1508032的抑菌圈直径显著增加（P<0.01）。添加外排泵抑制剂PAβN(50 mg·L-1）后，CFP,CAZ对菌株1708116的抑菌圈直径明显增大（P<0.05),MPN,CFP/SU对菌株1708116的抑菌圈直径显著增加（P<0.01）。且根据CLSI 2017年标准，头孢类抑菌圈直径折点≥18 mm为敏感菌；氨曲南抑菌圈直径折点≥22 mm为敏感菌，因此确定MDR-PA 1508032,1708116为外排泵表型阳性菌株。见表3。

表3外排泵阳性菌株筛选

3.2.2 Real-time

PCR检测MDR-PA外排泵相关基因的表达与PAO1比较，菌株1508032的外排泵基因mex-EF mRNA表达水平明显升高，是PAO1的3.8倍（P<0.05）；菌株1708116的外排泵基因mexXY mRNA表达水平是PAO1的4.8倍（P<0.05），说明菌株1508032,1708116外排泵基因高表达，是外排泵阳性菌株。菌株1608016的外排泵基因mexCD,mex-EF mRNA表达水平较PAO1均小于1倍（P<0.05），因此菌株1608016不是外排泵阳性菌株。见表4。

表4 PCR法筛选外排泵阳性菌株mRNA表达变化

3.3 TRQ对MDR-PA外排泵阳性菌株的影响

3.3.1联合用药对MDR-PA抑菌的作用

MDR-PA 1508032的CAZ,CFP,CFP/SU,AZT,AZL的抑菌环差值增大（P<0.05),MPN抑菌环差值不变，说明TRQ与前5种抗生素具有协同抗菌作用；MDR-PA 1708116的CAZ,CFP,CFP/SU,AZT,MPN,AZL的抑菌环差值明显增大（P<0.05），说明TRQ与此6种抗生素均有协同抗菌作用。见表5。

表5 TRQ对MDR-PA抑菌环差值的影响

3.3.2 TRQ对外排泵基因表达的影响

在上述实验6种抗生素中TRQ与CAZ,CFP,CFP/SU联合用药的抑菌环差值明显改变，且均为头孢菌素类抗生素，因此，选择这3种抗生素通过Real-time PCR比较观察药物对外排泵相关基因的影响。与空白组比较，TRQ作用MDR-PA 1508032可下调细菌外排泵基因mexAB,mexEF,mexXY mRNA的表达量，作用MDR-PA 1708116可下调mexAB,mexEF,mexXY mRNA的表达量（P<0.05），抗生素CAZ作用MDR-PA 1508032可下调mexCD,mexEF mRNA的表达量（P<0.05），抗生素CFP作用MDR-PA1508032,1708116均可下调mexAB,mexCD,mexEF,mexXY mRNA的表达量（P<0.05),CFP/SU作用MDR-PA 1508032可下调mexEF,mexXY mRNA的表达量；作用MDR-PA 1708116可下调mexXY mRNA的表达量（P<0.05），说明在抑制细菌外排泵基因表达水平方面，4种药物按作用效果强弱比较为CFP>TRQ>CAZ>CFP/SU，头孢菌素类抗生素主要筛查外排泵基因MexEF-oprN，即抑制mexEF的效果较佳，提示药物可通过改变细菌外排泵基因表达水平，使细菌耐药性减弱，降低抗生素临床使用剂量，从而起到抑菌作用。见表6。

表6 TRQ对细菌外排泵基因相对表达的影响

3.3.3 TRQ诱导MDR-PA后药物敏感性变化

与R0比较，TRQ连续诱导的R6菌株1508032,CAZ,CFP,CFP/SU,AZT,AZL的抑菌圈明显增大（P<0.05),MPN的抑菌圈无明显改变，差异无统计学意义；与R0比较，TRQ连续诱导的R6菌株1708116,CAZ,CFP/SU,CFP,MPN的抑菌圈明显增大（P<0.05），说明TRQ与CAZ,CFP,CFP/SU联合用药疗效较好，可能为TRQ中的药物成分促进β-内酰胺酶高度稳定的头孢菌素类抗生素的抑菌效果。AZT的抑菌圈出现减小趋势，提示TRQ与AZT长期联合用药可能出现拮抗作用，AZL的抑菌圈出现减小趋势，但无统计学意义。见表7。

4、 讨论

尽管抗菌药物的使用目前仍然是临床上治疗耐药菌感染最为常用的手段，但由于PA耐药机制复杂，抗生素的选择压力逐年增加。外排泵是PA耐药的主要作用机制之一，由内膜蛋白、连结蛋白和外膜蛋白三部分组成，目前研究主要集中于耐药结节化分裂（RND）家族的mex-AB,mex-CD,mex-EF,mex-XY[14]。PAβN是一种RND型外排泵抑制剂，能有效地结合外膜蛋白，破坏外排泵系统，恢复细菌对抗生素的敏感性[15]，因此本研究中用PAβN来筛选外排泵阳性菌。

本实验选取临床用药指南中用于治疗铜绿假单胞菌的6种指定抗生素，主要是CAZ,CFP,CFP/SU,MPN,AZL,AZT，以美罗培南筛查MexAB-oprM，阿洛西林筛查MexCD-oprJ，头孢他啶筛查MexEF-oprN，氨曲南筛查MexXY-OprM[16]。采用纸片扩散法联合外排泵抑制剂从表型上筛选外排泵阳性菌株，用Real-time PCR从基因水平上筛选外排泵阳性菌株。TRQ与抗生素联合作用，以及TRQ持续作用外排泵阳性菌株后，对抗生素抑菌影响的研究。

表7 TRQ连续诱导6次后不同抗生素对1508032和1708116抑菌作用的影响

在离体实验结果3.1项中，TRQ的药敏实验>16 500 mg·L-1，作用效果不明显；在结果3.3.1项中TRQ与6种抗生素联用效果良好，说明其用于悬浮状态的细菌效果不好，但与抗生素有联合用药有协同增效作用；在结果3.3.2项中TRQ可明显抑制MDR-PA1508032外排泵基因mexAB,mexEF,mexXY的表达水平，MDR-PA1708116两株菌的外排泵基因mexAB,mexCD,mexEF,mexXY的表达水平，CAZ和CFP/SU的效果与TRQ相比效果不佳，CFP的效果优于TRQ。在结果3.3.3项中TRQ长时间低剂量诱导后，可明显增强其对CAZ,CFP,CFP/SU 3种抗生素的敏感性，但MPN,AZT,AZL 3种抗生素效果不明显。

CAZ,CFP,CFP/SU均属于头孢菌素类抗生素，主治敏感细菌所致的感染，临床上其第4代降低了肾毒性，不仅能抑制革兰氏阳性菌，同时对革兰氏阴性菌也有作用，特别是绿脓杆菌。头孢菌素类是以头孢菌素类C为基础，其基本骨架为头孢烯，起抗菌活性作用的是头孢烯中的β-内酰胺环、双键及C-7位上的氨基[17,18]。本实验利用Real-time PCR，发现TRQ与此3种抗生素作用MDR-PA可下调外排泵基因mex-AB,mex-EF,mex-XY表达水平，与纸片扩散法联合外排泵抑制剂的实验结果一致。目前研究[19,20,21,22]表明，野生型PA中的外排蛋白MexAB-OprM对其天生的耐药性起重要作用，MexAB-OprM的失活可恢复野生型PA对多种抗菌药物的敏感性。MexXY外排泵的功能主要是通过外排胞内药物介导PA天然和获得性耐药，高表达MexXY菌株对药物耐药性升高2～16倍[23]。且TRQ注射液与头孢哌酮注射液、头孢他啶注射液体外配伍性质稳定；采用反相高效液相色谱法研究TRQ注射液与头孢哌酮注射液联合用药的体内药物代谢动力学，进一步考察药物的稳定性，结果显示两药联合前后的药动学参数均无显著变化，可指导临床用药[24]。综上所述，TRQ与抗生素具有协同抗菌效果，可能通过抑制外排泵基因过表达，改变外膜蛋白通透性，减少细菌耐药，达到抑制MDR-PA的作用，但在临床联合用药时，建议与CAZ,CFP,CFP/SU联合应用达到最大效果。随着人们对细菌耐药机制研究的深入，结合中药自身特点，与抗生素联用增加疗效，更好地指导临床合理用药，能有效地控制耐药率。

参考文献：

[5]李显志.铜绿假单胞菌多重药物耐药性外排泵十年研究回顾(英文)[J].中国抗生素杂志,2012,37(7):481-500.

[6]周云,凌保东.鲍曼不动杆菌抗生素主动外排泵转运系统与外排泵抑制剂[J].中国抗生素杂志,2012,37(5):321-328.

[7]孙影,顾觉奋.细菌外排泵抑制剂研究进展[J].药学进展,2018,42(6):411-419.

[8]翟贯星,陆璐,陈代杰,等.中药化合物的抗菌及增效作用[J].中国抗生素杂志,2019,32(17):1-5.

[9]方芳,李爽,陈旻,等.痰热清注射液联合头孢哌酮舒巴坦治疗耐药鲍曼不动杆菌老年重症肺部感染疗效观察[J].现代中西医结合杂志,2019,39(25):2791-2793.

[10]刘珏玲,杨伟峰,孙娅楠,等.痰热清注射液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜三维结构的影响[J].中国病原生物学杂志,2017,12(12):1152-1156.

[11]邢亚君,杨伟峰,孙娅楠,等.痰热清注射液与亚胺培南西司他丁联合对广泛耐药铜绿假单胞菌的抑菌作用[J].中国实验方剂学杂志,2019,25(11):60-66.

[13]王淋荆,曾建明,鲁洋,等.中药对多重耐药铜绿假单胞菌外排泵的作用研究[J].分子诊断与治疗杂志,2017,9(6):401-407,362.

[14]刘忆霜,肖春玲.细菌多重耐药外排泵抑制剂研究进展[J].中国抗生素杂志,2007,11(4):211-216,244.

[15]田菁菁,王敏,谢益欣,等.细菌对多黏菌素耐药机制的研究进展[J].临床检验杂志,2018,36(7):513-516.

[17]崔丽芬.头孢类抗生素分类与合理应用[J].世界最新医学信息文摘,2016,16(86):199,209.

[18]于海军.β-内酰胺类抗生素作用机制及头孢菌素发展[J].石家庄职业技术学院学报,2009,21(2):12-16.

[23]鞠晓红,王月华,孙艳美.铜绿假单胞菌MexXY外排泵调控机制研究进展[J].中国抗生素杂志,2019,44(1):40-46.

[24]孙照英.痰热清注射液与抗生素联合用药稳定性考察[D].哈尔滨:黑龙江中医药大学,2010.

李悦怡,李贤煜,杨伟峰,王毅,何忠梅.痰热清注射液与抗生素对多重耐药铜绿假单胞菌外排泵的作用[J].中国实验方剂学杂志,2020,26(14):92-98.