囊型棘球蚴病(Cystic echinococcosis, CE)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)幼虫引起的一种严重的人畜共患寄生虫病，呈全球性分布，中国的新疆、西藏、青海等省区是高流行区[1-2]。CE每年造成的经济损失估计高达12亿美元，世界卫生组织(World Health Organization, WHO)已将CE列为到2050年控制或根除的17种被忽视的热带病之一[2]。目前外科手术是治疗CE的主要手段，但对于中晚期患者可能并不适用，故选择药物治疗[3]。WHO推荐使用的是阿苯达唑类药物[4],但该药物溶解性差[5]、生物利用率低且有副作用[6],长期服用阿苯达唑，易导致寄生虫产生耐药性[7]。因此亟须找到新的药物靶点以提高CE的治疗效果。

Rad50是ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)超家族的成员之一[8],在DNA双链断裂处与MRE11和NBS1形成高度保守的复合体。Rad50蛋白形成MRN复合体在DNA的修整恢复、激活下游检查点、参与重组减数分裂和保持端粒长度等方面起着关键作用[9-10]。Rad50可以激活共济失调毛细血管扩张症突变(Ataxia telangiectasia mutated, ATM)信号通路，还能在ATM信号通路的下游发挥重要调节功能，从而对细胞周期中S期检验点和DNA损伤修复(DNA damage repair, DDR)起调控作用，达到维持基因组稳定性的作用[11]。

随着对DDR的深入研究，抑制DDR过程成为治疗癌症和寄生虫疾病的一种策略[12-16]。Rad50通过激活NF-κB信号通路诱导卵巢癌的侵袭性，即Rad50可能是一种预后生物标志物和卵巢癌的潜在治疗靶点[17]。利什曼原虫中Rad50基因的缺失导致染色体易位，严重影响其存活[14]。然而，关于EgRad50在CE中的研究鲜有报道，且尚不清楚EgRad50能否作为CE的药物靶点。本研究旨在从E.granulosus中克隆EgRad50基因，并通过生物信息学技术和分子生物学手段深入探究其生物学功能，为CE新药靶位的筛选提供重要依据。

一、材料与方法

1 材料

1.1 E.granulosus原头蚴的获取

于新疆乌鲁木齐市某屠宰场获得感染E.granulosus的绵羊肝脏，在无菌条件下取包囊液，待原头蚴自然沉淀后，过滤并弃去多余的囊液，使用含双抗的生理盐水对分离的原头蚴清洗3～5次，-80 ℃冻存。

1.2 主要试剂

胃蛋白酶(WXBB0725)及无菌无酶水(R1600)购自美国Sigma公司；1st cDNA逆转录试剂盒(6210A),PCR反应试剂盒(RR030A),DNA切胶回收试剂盒(9762),质粒纯化试剂盒(CW0500M),pMD19-T载体(6013),DH5α感受态细胞(CD201),加“A”尾试剂盒(6109)以及限制性内切酶EcoRI(1615)和Hind III(1611)均购自日本Takara公司；DL8000 DNA Maker(BM121),氨苄青霉素(A1170)购自北京康为世纪公司；Trizol(15596026),琼脂糖(1110GR100)购自美国Invitrogen公司。

2 方法

2.1 E.granulosus原头蚴总RNA的提取及其逆转录

在低温环境下，利用Trizol法提取E.granulosus原头蚴的总RNA,将总RNA逆转录成第一链cDNA,-80 ℃保存待用。

2.2 EgRad50基因克隆与测序

以美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)中获取EgRad50基因序列(Gene ID:XM_024489613.1)为模板，使用SnapGene v6.0.2软件设计特异性引物。上游引物EgRad50-F:5’-ATGTCTTTGCTGGAGGAGGTATG-3’;下游引物EgRad50-R:5’-TTACGTAACTTCAAGGAACTGA TCCT-3’,引物由上海生物工程股份有限公司合成。配制50 μL的RT-PCR反应体系：TaKaRa Ex Premier DNA Polymerase Dye plus (2X) 25 μL,上、下游引物各1 μL,第一链cDNA 2 μL,RNase Free dH2O 21 μL。根据最适宜反应条件于PCR扩增仪进行扩增，扩增条件为：94 ℃预热5 min; 94 ℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 68 ℃延伸4 min, 共35个循环。反应完成后取扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。胶回收与目的基因预期大小的PCR产物，纯化并加“A”尾后与pMD19-T载体连接，连接产物转入DH5α感受态细胞。筛选阳性克隆，获得的重组质粒交由新疆有康生物科技有限公司测序。测序结果通过SnapGene v6.0.2与blast分析。

2.3 EgRad50以及同源氨基酸序列

获取从NCBI的蛋白数据库中检索以EgRad50氨基酸序列为模板blast检索同源序列：细粒棘球绦虫(GenBank ID:EUB65095.1)、多房棘球绦虫(GenBank ID:CDS40165.1)、小口膜壳绦虫(GenBank ID:CDS30244.1)、日本血吸虫(GenBank ID:KAH8871421.1)、肝片形吸虫(GenBank ID:THD20542.1)、布氏姜片虫(GenBank ID:KAA0197239.1)、牛血吸虫(GenBank ID:RTG84224.1)、华支睾吸虫(GenBank ID:GAA50423.1)、乳头姬螺(GenBank ID:CAB3265404.1)、小鼠(GenBank ID:NP_033038.2)、智人(GenBank ID:NP_005723.2)、异色纤体鱼(GenBank ID:KFQ02873.1)、条纹裸皮蝇(GenBank ID:KFP90500.1)、对极巨眼蜂(GenBank ID:KAF1500504.1)、大杜鹃(GenBank ID:KFO70026.1)、波纹墨蛛(GenBank ID:XP_005147338.2)、蒙古乌鸦(GenBank ID:XP_031981266.1)、新荷兰牧蛛(GenBank ID:XP_025974038.1)、斜齿壶嘴虫(GenBank ID:XP_026953793.1)、驴(GenBank ID:XP_014712259.2)、虎(GenBank ID:XP_007087832.1)、热带爪蟾(GenBank ID:XP_012815225.1)、大胡鲶(GenBank ID:KAF5889211.1)、贝氏文昌鱼(GenBank ID:KAI8486181.1)。

2.4 EgRad50蛋白生物信息学分析

使用ExPASy在线分析网站预测细粒棘球绦虫EgRad50蛋白理化性质与蛋白亲疏水性[18]。随后在SignalP 5.0网站[19]氨基酸序列信号肽在线预测工具分析EgRad50信号肽、使用TMHMM 2.0网站[20]对EgRad50的蛋白跨膜结构域进行预测、采用ProtComp 9.0和Wolfpsort在线软件[21]对EgRad50进行亚细胞定位预测、利用Motif Scan和NetPhos 3.1网站[22]上对EgRad50蛋白的磷酸化位点进行预测。通过Conserved Domain Database (CDD)数据库[23]对EgRad50蛋白的结构域进行分析。通过SOPMA在线服务网站预测EgRad50蛋白二级结构、利用DNA star软件中的Protean程序对EgRad50的抗原指数、柔韧性和表面可及性进行预测分析[24]。通过Immune Epitope Data base(IEDB)在线预测软件预测EgRad50的B细胞抗原表位并运用vaxijen v2.0对其抗原性进行在线评估。通过SWISS-MODEL在线服务器对EgRad50与HsRad50序列进行同源建模，并采用VMD v1.9.4a53软件对模型进行可视化[25]。使用DNAMAN v9.0.1、Clustal Omega对EgRad50及同源蛋白序列进行比对分析，通过Jalview v2.11.3.2软件对EgRad50及同源蛋白序列进行可视化及美化。使用MEGA v11.0.13的邻接法，基于EgRad50及不同种属EgRad50基因构建系统进化关系[26]。

二、结果

1 EgRad50基因PCR扩增及测序

经1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增的目的片段大小与预期一致，约4 073 bp(图1)。扩增片段切胶回收后进行克隆转化，提取质粒后送测序验证，获得序列长为4 073 bp的EgRad50基因。测序显示EgRad50基因开放阅读框长度为4 073 bp, 测序结果已上传NCBI数据库(登录号：PP789594)。

图1EgRad50基因PCR扩增结果

M DNA标志物 1EgRad50基因PCR扩增产物

2 EgRad50的生物信息学分析

2.1 EgRad50的生理生化特征

EgRad50化学式为C6741H11133N1987O2173S52,包含1 377个氨基酸，分子质量为156.45 ku, 等电点为5.89,脂肪族氨基酸指数为89.14,不稳定指数是48.06,是一种不稳定蛋白。EgRad50包含多个亲水性区域，亲水性平均系数为-3.244～2.333,亲水性的总平均值(GRAVY)为-0.590,属于亲水性蛋白(图2)。

图2EgRad50基因编码蛋白的亲疏水性

2.2 EgRad50的信号肽、跨膜区域和亚细胞定位

EgRad50的信号肽(Sec/SPI)为0.0017,无信号肽裂解位点，也不存在跨膜区域(图3)。通过WoLF SPORT和ProtCompv. 9.0预测亚细胞定位结果表明EgRad50的亚细胞定位分布部位是细胞核和细胞质。

图3 EgRad50的跨膜结构及信号肽预测

2.3 EgRad50的翻译后修饰位点

通过MotifScan和NetPhos3.1Server预测翻译后修饰位点(Post-translational modification, PTM),EgRad50中有8个N-糖基化位点(位于36～39,342～345,716～719,809～812,845～848,857～860,1104～1107,1221～1224氨基酸区段),3个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点(位于127～130,385～388,1014～1017氨基酸区段),28个酪蛋白激酶II磷酸化位点(位于2～5,49～52,242～245,280～283,295～298,300～303,351～354,388～391,414～417,498～501,512～515,517～520,524～527,544～547,621～624,798～801,812～815,837～840,852～855,902～905,927～930,1008～1011,1106～1109,1136～1139,1211～1214,1258～1261,1300～1303,1333～1336氨基酸区段),8个N-豆蔻酰化位点(位于37～42,65～70,165～170,584～589,936～941,1091～1096,1174～1179,1247～1252氨基酸区段),33个蛋白激酶c磷酸化位点(位于38～40,44～46,109～111,113～115,118～120,125～127,139～141,202～204,230～232,384～386,400～402,418～420,427～429,498～500,548～550,556～558,605～607,662～664,688～690,753～755,811～813,837～839,859～861,872～874,940～942,972～974,1008～1010,1037～1039,1114～1116,1198～1200,1224～1226,1228～1230,1323～1325氨基酸区段),2个酪氨酸酶磷酸化位点(位于260～268,1304～1312氨基酸区段),1个亮氨酸拉链(位于234～255氨基酸区段)(图4)。

图4 EgRad50磷酸化位点

2.4 EgRad50结构域

EgRad50包括ATP酶相关(ATPases associated, AAA)特征结构域，位于2-393氨基酸序列，该结构域具有高ATP酶活性，特征在于保守的核苷酸磷酸结合基序；DNA双链断裂修复ATP酶结构域，位于444-993氨基酸序列；ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)结构域，位于1260-1362氨基酸序列，结构域具有保守性且发挥Rad50结合ATP的功能(图5)。

图5 EgRad50的保守结构域

2.5 EgRad50二级结构

通过SOPMA分析EgRad50的二级结构(包括α螺旋，β折叠，β转角和无规卷曲)。EgRad50氨基酸序列长度是1377,其中α螺旋约占77.41%,β折叠约占6.25%,β转角约占2.25%,无规卷曲约占14.09%(图6)。

图6 EgRad50二级结构预测

2.6 EgRad50蛋白的抗原表位

利用DNAstar软件对EgRad50的柔性区、表面可及区和抗原指数进行预测分析(图7),结合IEDB在预测软件预测其B细胞抗原表位有37条，并采用vaxijen v2.0评估其抗原性，得到7条预测表位结果见表1。

表1 EgRad50 B细胞抗原表位

图7 EgRad50柔韧性、抗原性指数和表面可及性分析

2.7 EgRad50的3D结构

通过Swiss-Model服务器构建的EgRad50 3D结构与模板序列同源性为81.97%,GMQE得分为0.63。通过Swiss-Model服务器构建的HsRad50 3D结构与模板序列同源性为92.23%,GMQE得分为0.83。利用VMD可视化软件呈现EgRad50和HsRad50的3D结构中的氨基酸结合位点，结果见图8。

3 EgRad50及其同源基因的多重序列比对

通过DNAMAN软件的比对分析，EgRad50与其同源序列(GenBank ID:CDS40165.1、CDS30244.1、KAH8871421.1、THD20542.1、KAA0197239.1、RTG84224.1、GAA50423.1、CAB3265404.1、NP_033038.2、NP_005723.2)的相似性依次为92.70%、58.45%、40.24%、37.49%、37.14%、37.07%、36.84%、31.74%、30.54%、29.78%,与多房棘球绦虫(GenBank: CDS40165.1)相似性为92.70%,与智人、小鼠等其他物种的相似性为29.78%～58.45%(图9)。

图8 EgRad50三级结构预测

图9 EgRad50蛋白的多序列比对

4 EgRad50的系统进化关系

根据MEGA11.0.13软件对比后的结果绘制进化树。结果表明EgRad50具有多个分支，EgRad50与多房棘球绦虫、小口膜壳绦虫、日本血吸虫和布氏姜片虫同属于一个分支，进化关系较近，与智人、小鼠进化关系较远(图10)。

5 蛋白互作关系

通过String在线软件分析EgRad50蛋白的互作网络，结果显示：该蛋白与细粒棘球绦虫MRE11、Nibrin、ATM、ATR、Ku80、BRCA1、BRAD等蛋白存在互作关系(图11)。GO富集分析显示，EgRad50蛋白主要参与DNA修复、细胞进程以及端粒维持等生物过程。

三、讨论

由于目前药物治疗CE时存在的局限性，迫切需要筛选新的药物靶点并开发新型药物。生物信息学作为一种高效、快速处理和分析生物数据的技术，在药物靶点筛选和生物学功能预测中展现出了巨大的应用潜力[27-30]。鉴于MRN复合体在维持基因组稳定中的核心作用，而Rad50作为MRN复合体的关键组分，对于理解DNA损伤修复机制具有重要意义[31]。Tsai等[32]通过基因组测序获得了EgRad50基因的序列信息，但尚未对EgRad50进行深入研究。

图10 EgRad50系统进化树

图11 EgRad50互作蛋白分析

本研究成功克隆出EgRad50基因证明E.granulosus中存在EgRad50基因并分析了其编码蛋白的氨基酸序列。EgRad50二级结构分析表明，EgRad50蛋白中α螺旋占77.41%,α螺旋参与构成蛋白骨架，支撑蛋白的结构与构象，因此在一定程度上保证了EgRad50蛋白的稳定性。

DNA损伤修复途径在寄生虫生存中发挥关键作用[14-16]。结构域预测结果显示，EgRad50具有ABC-Rad50结构域，该结构域具有保守性且发挥Rad50结合ATP的功能[8],其有助于激活ATM信号通路，对细胞检验点和DNA损伤修复起调控作用[33]。3D结构预测显示，EgRad50与智人Rad50在蛋白构象和功能上差异较大，同源基因序列比对分析表明EgRad50与智人Rad50的相似性仅为29.78%。系统发育树分析显示，EgRad50与智人、小鼠等Rad50亲缘关系较远，反映不同物种在进化过程中的分化和差异，提示EgRad50在结构和功能上的独特性。

蛋白-蛋白相互作用分析显示，EgRad50与DNA损伤修复相关蛋白存在紧密的相互作用关系。EgRad50可能通过与上述DNA损伤修复蛋白的协同作用，识别并修复DNA损伤，确保遗传信息的完整。同时参与细胞生长、细胞分裂以及端粒维持等关键进程，维持细胞正常功能[9-10]。因此EgRad50可能作为E.granulosus体内DNA损伤修复途径的关键蛋白之一，参与维持基因组的稳定。

综上所述，本试验成功克隆并鉴定了EgRad50基因，生物信息学预测结果表明EgRad50蛋白主要参与DNA修复、细胞进程以及端粒维持等生物过程，是DNA损伤修复途径的重要蛋白，为进一步了解E.granulosus的DNA损伤修复机制提供了重要的研究基础。

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基金资助:国家自然科学基金项目(No.82160700); 新疆维吾尔自治区“天山英才”医药卫生高层次人才培养项目(No.TSYC202301A051);

文章来源:赵金龙,许少全,周润,等.细粒棘球绦虫DNA损伤修复蛋白Rad50的生物信息学分析[J].中国病原生物学杂志,2024,19(11):1305-1311.