世界卫生组织将棘球蚴病列为17种被忽视的疾病之一,细粒棘球蚴病在人群中发病率达每年150例/10万人,全球因细粒棘球蚴病而丧失的伤残调整生命年数目每年高达285500人[1-2]｡我国是棘球蚴病疫病区最为严重的国家,细粒棘球蚴病是棘球蚴病最高发的类型,在中国约占所有棘球蚴病病例的80%[3]｡细粒棘绦虫卵污染的水和食物被人误食后,通过消化液的作用孵化出六钩蚴,六钩蚴侵入肠壁进入血液循环,随血液循环入侵肝和肺,造成占位性病变｡而且棘球蚴病潜伏期长达数年甚至数十年,病例被发现时,疾病已进展到只能采取手术治疗中晚期,给家庭和社会带来了巨大的经济负担｡

巨噬细胞是参与棘球蚴病囊肿局部反应的主要免疫细胞之一,在细粒棘球蚴病发生发展中发挥着至关重要的作用｡巨噬细胞极化表型分为经典途径激活型(M1型)和可替代途径激活型(M2型)｡在细粒棘球蚴的寄生期间,机体主要是以M1型巨噬细胞极化和促炎因子(IL-1β､IL-2､IL-12､IL-17､IL-18､IFN-γ和TNF-α)的大量分泌为主;在修复虫体对机体破坏期间,机体主要是以M2型巨噬细胞极化和抑炎因子(IL-4､IL-6､IL-10､IL-11､IL-13和TGF-β)的大量分泌为主,二者比例的变化与细粒棘球蚴感染的疾病进展有着密切关系[4-5]｡在疾病进展期间,巨噬细胞极化会受到免疫微环境中多种细胞因子的影响,外泌体作为细粒棘球蚴原头蚴分泌物质,在巨噬细胞极化中起到了重要作用｡

外泌体指30~150nm的细胞外囊泡,包括DNA､RNA､脂质､代谢物､胞质和细胞表面蛋白｡在肿瘤､心血管系统､神经系统等疾病中均发现外泌体可以调节巨噬细胞极化,但是在细粒棘球绦虫原头蚴外泌体对巨噬细胞极化的影响鲜有研究｡基于以上研究背景,本研究为探究细粒棘球绦虫原头蚴外泌体对巨噬细胞极化的影响,将成功提取的外泌体加入培养基中进行巨噬细胞培养,采用流式细胞术､Westernblot､qRT-PCR和ELISA技术检测巨噬细胞两种极化方向的标志物变化情况｡

1､材料与方法

1材料

1.1细粒棘球绦虫原头蚴

取自50个感染细粒棘球蚴病的绵羊肝脏,肝脏均来自乌鲁木齐市米东区的华凌屠宰场,屠宰场兽医在检疫发现感染的肝脏并提供给本实验室｡

1.2试剂

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)购自武汉博士德生物工程有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京碧云天科技有限公司;CD86､CD206､F4/80流式抗体购自美国biolegend公司;青霉素(100U/mL)-链霉素(100μg/mL)双抗溶液购自武汉赛维尔生物科技有限公司;IL-10､IL-1β､TNF-α和TGF-β的ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司;AmiconUltra-15100ku超滤管购自德国merckmillipore公司;引物扩增体系购自北京全式金生物技术有限公司;TSG101抗体､CD63抗体､iNOS抗体和Arg-1抗体购自美国Abcam公司｡

2方法

2.1细粒棘球蚴原头蚴培养和上清液收集

无菌条件下,从吸出的囊液和囊壁清洗液中,沉降得到原头蚴,其中将囊液在超净台中用0.22μm的滤器进行过滤后分装,BCA试剂盒测定细粒棘球蚴囊液的蛋白浓度,放到-80℃冰箱中保存备用｡用pH3.0的1%胃蛋白酶激活所得到的原头蚴｡将原头蚴转移至T25培养瓶,接种密度为2000头/瓶,置于37℃的5%CO2培养箱中培养,收集培养上清,放入-80℃保存｡

2.2细粒棘球绦虫原头蚴外泌体提取以及鉴定

用AmiconUltra-15100ku超滤管浓缩细粒棘球蚴培养上清后,差速离心法提取上清中外泌体,4℃､300g离心10min,取上清;4℃､2000g离心10min,取上清;4℃､10000g离心30min,取上清;4℃､100000g离心70min,弃上清PBS重悬沉淀｡BCA试剂盒测定细粒棘球绦虫原头节外泌体的蛋白浓度,透射电镜检测其形态,Westernblot检测其特异性表面标志物CD63和TGS101的表达,ZS90纳米粒径仪检测其直径｡

2.3巨噬细胞吞噬细粒棘球绦虫原头蚴外泌体验证

将稀释成100μmol/L的PKH67工作液与200μL浓度为0.5μg/μL的细粒棘球绦虫原头蚴外泌体混合孵育10min,差速离心法提取外泌体,RAW264.7巨噬细胞按照1×107个/孔接种于六孔板内,每组设置3个重复孔｡加入20μL经PKH67工作液孵育的外泌体进行24h共培养,弃上清,DAPI进行核染色,加入固定液,荧光显微镜下观察巨噬细胞摄取外泌体情况｡

2.4巨噬细胞共培养

巨噬细胞以1×107个/孔接种于六孔板内,设置3个重复孔｡细胞贴壁后,Control组加入20μL的PBS进巨噬细胞;EgCF组加入2mg/mL的无菌囊液与巨噬细胞共培养;Exo组细粒棘球绦虫原头蚴外泌体10μg/mL与巨噬细胞共培养｡放入5%CO2的细胞培养箱培养24h后,收集细胞｡

2.5Westernblot收集

Control组和Exo组刺激好的细胞,用BCA蛋白浓度定量法定量后,-20℃保存｡每泳道加入20μg蛋白,通过电泳､转模､封闭､一抗孵育､二抗孵育和显色,以β-actin为内参,计算M1型特异性标志物iNOS和M2型特异性标志物Arg-1蛋白的相对表达量｡

2.6qRT-PCR使用

Trizol提取Control组和Exo组巨噬细胞总RNA,检测RNA浓度｡使用反转录试剂盒将所提取的RNA反转录为cDNA,根据试剂盒说明书配制PCR反应体系｡检测M1型特异性标志物iNOS和M2型特异性标志物Arg-1的mRNA的相对表达情况,引物序列见表1｡表1引物序列Table1primersequences名称引物序列(5′-3′)iNOSF:ATGGCAACATCAGGTCGGR:GCACAACTGGGTGAACTCCArg-1F:GTGGCAGAGGTCCAGAAGAR:GGTTGTCAGGGGAGTGTTGβ-actinF:CAGCCTTCCTTCTTGGGTATGR:GGCATAGAGGTCTTTACGGATG

2.7流式细胞术收集

Control组､EgCF组和Exo组的巨噬细胞,1000g离心5min后,200μL的无菌PBS重悬｡吹打混匀后计数,1×105~1×106个细胞放入无菌的1.5mLEP管中｡总荧光混合液(PE-F4/80≤0.2μL/106个细胞､FITC-CD86≤0.2μL/106个细胞､APC-CD206≤0.25μL/106个细胞)[6]的用量,每个样品加入混合液0.65μL,避光孵育后离心,弃上清;重悬细胞滤网过滤,检测｡

2.8ELISA

根据ELISA试剂盒说明书检测并计算Control组､EgCF组和Exo组巨噬细胞培养上清IL-10､IL-1β､TGF-β和TNFα在Control组､EgCF组和Exo组之中的浓度｡

3统计学方法

实验数据均采用SPSS26.0和GraghpadPrism9.5.1进行分析,以均数±标准差(x±s)表示｡通过t检验和单因素方差分析及多重比较进行数据的统计分析,设置P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

1细粒棘球绦虫原头蚴外泌体提取及鉴定

差速离心法提取了细粒棘球绦虫原头蚴外泌体具有双层膜结构的物质,呈茶托型或杯型(图1A);外泌体的直径峰值在89nm左右,平均直径为117.8nm(图1B);细粒棘球绦虫原头蚴外泌体特征性蛋白CD63在65ku有表达､TSG101在46ku有表达(图1C),CD63的灰度值/内参灰度值为0.64;TSG101的灰度值/内参灰度值为2.11｡

图1外泌体特异性表征鉴定结果

2巨噬细胞吞噬细粒棘球绦虫原头蚴外泌体的情况

PKH67染液使得细粒棘球绦虫原头蚴外泌体带有绿色荧光,DAPI使得巨噬细胞细胞核带有蓝色荧光(图2),低倍镜下可以发现,带有绿色荧光的外泌体与巨噬细胞部分重合;高倍镜下可以发现,大部分带有绿色荧光的外泌体在蓝染的巨噬细胞核之中｡

3Westernblot和qRT-PCR检测

Control组和Exo组巨噬细胞iNOS和Arg-1的表达Westernblot蛋白条带如图3A所示,iNOS是M1型巨噬细胞的特异性蛋白,Arg-1是M2型巨噬细胞的特异性蛋白｡如图3B,Exo组的iNOS蛋白表达量(4319.95±46.32)较Control组(1374.95±4.03)表达量高,两组比较有统计学意义(t=15.40,P<0.01)｡如图3C,Exo组的Arg-1蛋白表达量(5653.85±35.43)较Control组(1374.95±4.03)表达高,两组比较有统计学意义(t=18.69,P<0.01)升高｡另外,iNOSmRNA相对表达量(图3D)Exo组(2.51±0.25)较Control组(1.00±0.09)表达量高,两组比较有统计学意义(t=9.574,P<0.01)｡Arg-1mRNA相对表达量(如图3E)Exo组(3.09±0.29)较Control组(1.00±0.03)高,两组比较有统计学意义(t=12.36,P<0.01)｡Exo组以M2型巨噬细胞为主｡巨噬细胞与细粒棘球绦虫原头蚴外泌体和细粒棘球蚴囊液共培养24h后,M1和M2特征性蛋白均升高,Exo组细胞的极化状态偏向M2｡

图2低倍镜(200×)和高倍镜(400×)下巨噬细胞吞噬PKH67染色外泌体

图3Westernblot和qRT-PCR检测各组特异性指标的表达

4流式细胞术检测

Control组､Exo组和EgCF组的细胞的F4/80､CD86和CD206的表达流式细胞术划门结果见图4A,Exo组的F4/80+CD86+细胞占总细胞数(图44)的为(23.17±7.59)%,较EgCF组(7.47±4.54)%高,两组比较有统计学意义(t=3.076,P<0.05);Exo组的F4/80+CD206+细胞占总细胞数(如图5C)的为(33.17±8.12)%,较EgCF组(15.08±7.75)%高,两组比较有统计学意义(t=2.790,P<0.05)｡

图4流式细胞术检测各组F4/80､CD86和CD206的表达

图5ELISA检测各组的相关分泌因子的表达情况

5通过ELISA法检测细胞培养上清中IL-1β､IL-10､TNF-α和TGF-β的浓度细胞

培养上清中IL-1β､IL-10､TNF-α和TGF-β各组浓度数据以及统计学值如表2所示｡Exo组的IL-1β浓度(如图5A)为(90.57±2.79)pg/mL,较Control组(5.75±0.68)pg/mL浓度高,但较EgCF组(222.90±5.91)pg/mL浓度低,三组差异有统计学意义(F=1.512,P<0.01)｡Exo组的TNF-α浓度(如图5B)为(68993.47±2576.05)pg/mL,较Control组(5596.77±366.13)pg/mL浓度高,但较EgCF组(114341.05±2808.48)pg/mL浓度低,三组差异有统计学意义(F=1.011,P<0.01)｡Exo组的TGF-β浓度(如图5C)为(1002.84±22.11)pg/mL,较Control组(550.80±11.59)pg/mL和EgCF组(886.35±1.25)pg/mL均更高,三组差异有统计学意义(F=1.566,P<0.01)｡Exo组的IL-10浓(如图5D)度为(42.97±0.73)pg/mL,较Control组(10.83±0.35)pg/mL和EgCF组(29.64±0.76)pg/mL均更高,三组比较有统计学意义(F=0.4383,P<0.01)｡相比于Control组和EgCF组,Exo组中促炎因子和抑炎因子的浓度均升高,主要以抑炎因子升高为主｡

表2各组细胞培养上清ELISA结果

3、讨论

外泌体是指直径为30~150nm的细胞外囊泡,成分复杂,当被巨噬细胞吞噬后,可影响其巨噬细胞的极化过程｡在多房棘球绦虫原头蚴外泌体的研究中就证明了其可以促进巨噬细胞极化且以M2极化占主导地位[7],例如miR-133a可以减轻肝损伤和纤维化[8];emu-let-7-5p可以促使巨噬细胞向M2方向极化[9];emu-miR-71则可被巨噬细胞摄取从而调节巨噬细胞的功能[10]｡本研究外泌体可以促进巨噬细胞向M1和M2方向极化,且以M2型巨噬细胞为主｡近年研究发现,囊尾蚴源外泌体和利什曼原虫(Leishmania)源外泌体可抑制巨噬细胞NO和IL-12的产生,而显著促进巨噬细胞增殖和M2型免疫相关因子的表达[11-12];疟原虫源外泌体和弓形虫源外泌体会引发过度的促炎反应并使巨噬细胞朝向M1型极化等[13-14]｡弓形虫外泌体可以激活MAPK/JNK信号通路和NF-κB信号通路[14]｡本研究使用细粒棘球绦虫原头蚴外泌体来处理巨噬细胞,通过PKH67染色实验发现,巨噬细胞可以内化细粒棘球绦虫原头蚴外泌体,当外泌体被巨噬细胞吞噬后,M1型巨噬细胞特异性指标iNOS和M2特异性指标Arg-1的蛋白以及mRNA表达均较Control组显著升高｡通过流式细胞术发现,Exo组中M1标志物CD86和M2标志物CD206表达量均较Control组升高｡Exo组中M1型巨噬细胞激活的细胞因子IL-1β和TNF-α的表达显著高于对照组,而M2巨噬细胞激活的细胞因子IL10和TGF-β的表达均较Control组显著升高｡虽然囊尾蚴源外泌体和利什曼原虫源外泌体相较于疟原虫源外泌体和弓形虫源外泌体结果不一致｡外泌体成分复杂,不同种属的寄生虫也不一致,本课题组将进一步进行蛋白质谱检验来挖掘其中复杂的作用机制｡

细粒棘球蚴囊液的成分复杂,内含多种蛋白､肌醇､卵磷脂､尿素及少量糖､无机盐和酶｡曾有研究证实细粒棘球蚴囊液通过PI3K/AKT/NF-κB通路的激活促使巨噬细胞向M1表型的极化[15]｡也有研究证实细粒棘球蚴囊液可以促进巨噬细胞通过促进STAT6的表达从而上调M2的表达[16]｡流式细胞术和ELISA实验均表明,EgCF组M1特异性指标和M2特异性指标均高于Control组｡流式细胞术表明,Exo组M1和M2特异性指标均于高与EgCF组,在ELISA实验中显示M2巨噬细胞激活的细胞因子IL-10和TGF-βExo组较EgCF组表达高,M1巨噬细胞激活的细胞因子IL-1β和TNF-αExo组较EgCF组表达低｡ELISA与流式细胞术检验结果不一致,推测为囊液内含多种成分导致｡

细粒棘球蚴细粒棘球蚴继发感染小鼠模型的血清和腹腔灌洗液中,M1型巨噬细胞相关因子例如IL-1β､IL-6､TNF-α和iNOS在早期的小鼠模型血清中呈逐渐升高趋势,在中后期的小鼠模型开始出现巨噬细胞极化转化｡M2型巨噬细胞相关因子例如Arg-1､IL-10､TGF-β在早期的小鼠模型血清中变化不明显,而在中后期的小鼠模型血清中呈逐渐升高趋势,本研究结果与感染中后期结果一致[17]｡对患病者血液和健康人血液进行血清学检测和对比后,可以发现与健康人相比细粒棘球蚴患病者血清中M1和M2型细胞相关细胞因子TNF-α､IL-10和TGF-β表达水平均升高,且M2型巨噬细胞相关因子的升高更为明显,由于患病者病程多数位于细粒棘球蚴感染中后期,说明M2型巨噬细胞在细粒棘球蚴病的感染中后期发挥着重要作用[18]｡因此,人体样本以及小鼠模型都说明M1型巨噬细胞主要出现于细粒棘球蚴感染早期,从感染中后期开始从M1型巨噬细胞转化M2型巨噬细胞｡本研究结果显示,细粒棘球绦虫原头蚴外泌体可以促使巨噬细胞极化,且偏向M2型,因此课题组推测细粒棘球绦虫原头蚴外泌体在感染中后期的纤维修复过程中可能发挥重要作用｡

综上所述,细粒棘球绦虫原头蚴外泌体均可促使巨噬细胞极化,发现细粒棘球绦虫原头蚴外泌体可促进巨噬细胞细胞极化,且细胞的极化状态更偏向M2｡

参考文献:

[2]于涛,王利磊,赵慧卿,等.细粒棘球蚴病疫苗的研制现状[J].中国病原生物学杂志,2024,19(1):107-112.

[4]焦红杰,齐文静,郭刚,等.细粒棘球蚴抗原B对小鼠巨噬细胞RAW264.7的极化作用[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2023,41(1):23-28.

基金资助:国家自然科学基金项目(No.82360127);新疆维吾尔自治区自然科学基金重点项目(No.2022D01D73);省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室开放课题资助项目(No.SKL-HIDCA-2022-40);

文章来源:李佳峻,周璇,王亮,等.细粒棘球绦虫原头蚴外泌体对巨噬细胞M2极化调节作用研究[J].中国病原生物学杂志,2025,20(06):691-695+702.