骨囊型棘球蚴病(bone cystic echinococcosis,bone CE)是所有棘球蚴病感染中最复杂、最危险的一种。尽管骨CE较为罕见,占所有CE感染病例的0.5%～4.0%[1]。然而骨CE最常见感染部位为脊柱,其次为骨盆,二者总计超过骨CE病例的70%[2]。根治性切除手术联合阿苯达唑用药是主要的治疗方法[3]。但是骨CE复发率高达40%以上,且预后不良,脊柱变形、盆腔髋关节和骶髂关节合并感染、下肢瘫痪和死亡率高[4]。骨CE的组织病理学染色切片可见单个或多个囊肿,囊肿内可见透明液体伴葡萄样囊肿,为层压层状纤维化囊。原发性和继发性CE感染通过循环系统到达阻力较小的松质骨部位,由松质骨向皮质骨侵蚀性生长,在此过程中CE以未知机制激活破骨细胞,溶解周围骨组织[5-6]。

TAZ (transcriptional coactivator with PDZ-binding motif),又称为含有WW结构域的转录调节因子1,是Hippo信号通路下游的一种核心效应因子。它们在促进成骨细胞分化和维持骨稳态中发挥重要作用[7]。转化生长因子β-活化激酶1 (transforming growth factorβ-activated kinase 1,TAK1)可与TAZ直接结合并磷酸化TAZ,介导其降解[8]。而TAZ可通过抑制TAK1与底物的结合以减弱NF-κB的信号[9]。核因子κB受体激活配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)是NF-κB受体的激活配体,激活NF-κB亚基,如介导磷酸化P65后将其活化并转位至细胞核,进而激活转录因子NFATc1的转录和表达,介导破骨细胞分化相关基因的转录[10]。在本研究中,拟使用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,MCSF)联合可溶性RANKL,外加/不加包虫抗原B (hydatid antigen B,Hyd-B)联合诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向破骨细胞分化。通过检测分化标志物的表达情况,探讨Hyd-B对破骨细胞发生的影响。通过体外过表达TAZ,探讨TAZ对Hyd-B促进破骨细胞分化的影响及其分子作用机制。

1、实验材料与方法

1.1实验材料

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)购自武汉普诺赛生物科技有限公司(中国)。腺病毒载体p ADV-m CMV-3 x FLAG-EGFP购自上海和元生物(中国),并委托其代为完成腺病毒颗粒的包装实验。RNAprep Pure动物组织总RNA提取试剂盒(货号DP431),Fast King c DNA第一链合成试剂盒(去基因组)(货号KR116),Talent荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(货号FP209)购自北京天根生化(中国)。委托上海生工生物(中国)代为设计和合成TAZ ORF扩增引物对以及q PCR扩增引物对。细胞核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒(货号D-AKE3001-50T)购自湖北艾美捷科技(中国)。Dynabeads蛋白A/G及磁架起始套装(货号10015D),抗体:兔抗p-P65多抗(货号PA5-121302)、抗P65多抗(货号51-0500)、抗p-AKT多抗(货号PA5-36780)、抗AKT多抗(货号44-609G)、抗pERK1/2多抗(货号44-680G)、ERK1/2 (货号61-7400)、抗NFATc1单抗(货号MA5-32686)、抗p-TAZ多抗(货号PA5-105066)、抗TAZ多抗(货号PA5-81062)、抗TAK1多抗(货号A301-915A)、抗GAPDH单抗(货号MA5-15738),山羊抗兔HRP-Ig G二抗(货号31460)购自Thermo Fisher Scientific (美国)。重组人MCSF (货号H6916),重组人RANKL (货号T3573)购自Sigma-Aldrich (美国)。

1.2方法

1.2.1细胞培养

BMSCs培养于补充有10%胎牛血清的DMEM完全培养液中,并添加10 U/m L青-链霉素。置于通入5%CO2的37℃恒温、湿润的细胞孵育箱中维持培养。

1.2.2细胞实验分组和处理方式

BMSCs细胞实验分组-1:(1) Control组,BMSCs不做任何处理;(2) MCSF+RANKL组,BMSCs培养液中加入30ng/m L MCSF和50 ng/m L RANKL;(3) MCSF+RANKL+Hyd-B组,BMSCs培养液中加入30 ng/m L MCSF+50 ng/m L RANKL+25 ng/m L Hyd-B。上述(2)、(3)组连续诱导处理8 d,每间隔2天换液一次,每次换液一半新鲜培养液并添加上述处理因子(MCSF,RANKL和/或Hyd-B)[11-12]。BMSCs细胞实验分组-2:(1) Ctrl组,BMSCs不做任何处理;(2) Hyd-B处理(Treat)组,BMSCs培养液中加入50 ng/m L Hyd-B,连续处理48 h[11]。BMSCs细胞实验分组-3:(1) Control组;(2) MCSF+RANKL组;(3) MCSF+RANKL+Hyd-B组;(4)MCSF+RANKL+Hyd-B+TAZ OE组;(5) MCSF+RANKL+Hyd-B+OE vector组。(1)～(3)组处理方式同“细胞实验分组-1”,(4)和(5)组预先转染腺病毒-TAZ OE或腺病毒-OE vector后48 h再同“细胞实验分组-1”中(3)的方式处理BMSCs。

1.2.3 Hyd-B的制备

采用大肠埃希菌原核表达系统人工制备重组Hyd-B[13]。使用p Mal-c2x载体进行原核表达。使用直链淀粉树脂层析柱进行纯化。通过SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白纯度后,4℃冷藏或置于-20℃冷冻保存,备用。

1.2.4使用腺病毒载体p ADV-m CMV-3 x FLAG-EGFP介导过表达

TAZ ORF扩增引物对:TAZ FP(5′-3′)为AGAAACCTCAGAGTGACTAAA,TAZ RP (5′-3′)为GTCCTCACTCATCGTCTTCGT。腺病毒-TAZ OE或腺病毒-OE vector颗粒转染BMSCs的滴度为1×109PFU/ml。转染操作按照常规操作流程进行即可。

1.2.5 q PCR分析靶基因m RNA相对表达水平

加入1 m L Trizol裂解液裂解6-孔板每皿细胞使用RNAprep Pure动物组织总RNA提取试剂盒提取总RNA。使用Fast King c DNA第一链合成试剂盒(去基因组)反转录合成c DNA。使用Talent荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(货号FP209)进行q PCR扩增。引物对序列如下:TRAP FP (5′-3′)为CTCCCCGATCTGCGGCCAC,TRAP RP (5′-3′)为CTGACCCAATCATCTGGGTG;Cathepsin K FP (5′-3′)为GAAACGAAGCCAGACAACAG,Cathepsin K RP (5′-3′)为CTTCCATAGCTCCCAGT-GG;GAPDH FP (5′-3′)为GGTAGAGCGGCCGC-CATGT,GAPDH RP (5′-3′)为CAGCTAGCCTCG-CTCCACCT。

1.2.6蛋白质印迹

加含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解6-孔板每皿细胞,提取总蛋白质。使用细胞核蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒分别提取细胞核蛋白和胞浆蛋白。进行常规SDS-PAGE凝胶电泳。采用半干转印法将PAGE凝胶上的蛋白质电转印至PVDF膜上。使用5%脱脂奶粉对PVDF膜进行室温封闭,1 h。向膜上滴加一抗工作液,在4℃下孵育过夜。次日,向膜上滴加二抗工作液,室温孵育1 h。抗体工作液稀释度如下:p-P65 (1∶1 000)、P65 (1∶1 500)、p-AKT (1∶1 000)、AKT (1∶1 500)、p-ERK 1/2 (1∶1 000)、ERK 1/2 (1∶1 500)、NFATc1 (1∶1 000)、p-TAZ(1∶1 000)、TAZ (1∶1 500)、TAK1 (1∶1 500)、GAPDH (1∶1 500),HRP-Ig G二抗(1∶5 000)。

1.2.7免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,coIP)

使用Dynabeads蛋白A/G及磁架起始套装对“细胞实验分组-2”的细胞进行co-IP实验。使用细胞总蛋白质提取物进行蛋白质印迹法检测Input中TAZ和TAK1的表达量。抗体稀释度为抗TAZ抗体(1∶1 500)、抗TAK1抗体(1∶1 500)。使用抗Ig G抗体和抗TAK1抗体下拉(IP)蛋白质。IB (immuno blot)检测TAZ,抗体稀释度为抗TAZ抗体(1∶500)。

1.2.8统计学处理

计量数据表示以平均值±标准差的形式表示。使用Graph Pad Prism v8软件进行统计学分析。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(one way ANOVA)。P<0.05时为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 Hyd-B增强MCSF/RANKL介导的BMSCs向破骨细胞的分化

为了探讨不同处理对BMSCs向破骨细胞分化的影响,采用q PCR法测定破骨细胞分化标志物TRAP和Cathepsin K m RNA的相对表达水平(图1),与Control组相比,MCSF+RANKL组和MCSF+RANKL+Hyd-B组细胞TRAP和Cathepsin K m RNA水平升高(P<0.05)。与MCSF+RANKL组相比,MCSF+RANKL+Hyd-B组细胞TRAP和Cathepsin K m RNA水平升高(P<0.05),Hyd-B增强MCSF/RANKL介导的BMSCs向破骨细胞的分化。

2.2包虫抗原B增强MCSF/RANKL介导的BMSCs中NF-κB/AKT/ERK 1/2的活化水平

为了探究不同处理对BMSCs内向破骨细胞分化关键转录因子和信号通路表达水平的影响,采用蛋白质印迹法测定破骨细胞分化关键信号通路相关蛋白质因子p-P65、P65、p-AKT、AKT、p-ERK 1/2和ERK1/2,以及细胞核内关键转录因子p-P65、NFATc1和细胞质内P65的表达水平(图2A),与Control组相比,MCSF+RANKL组和MCSF+RANKL+Hyd-B组细胞p-P65、p-AKT、p-ERK 1/2水平升高(P<0.05)。与MCSF+RANKL组相比,MCSF+RANKL+HydB组细胞p-P65、p-AKT、p-ERK 1/2水平升高(P<0.05)。如图2B,与Control组相比,MCSF+RANKL组和MCSF+RANKL+Hyd-B组细胞细胞核内p-P65和NFATc1的水平升高(P<0.05)。与MCSF+RANKL组相比,MCSF+RANKL+Hyd-B组细胞核内p-P65和NFATc1的水平升高(P<0.05)。P65、AKT和ERK 1/2在各分组间无显著性差异(P>0.05),Hyd-B增强了MCSF/RANKL介导的BMSCs中NF-κB/AKT/ERK 1/2的活化水平。

图1不同处理对BMSCs向破骨细胞分化标志物m RNA表达水平的影响

qPCR法测定不同处理对BMSCs向破骨细胞分化标志物TRAP和Cathepsin K m RNA表达水平的影响。两两比较如图所示,*P<0.05。

图2不同处理对BMSCs内向破骨细胞分化关键转录因子和信号通路表达水平的影响

2.3 Hyd-B抑制TAZ和TAK1的直接结合和相互作用

为了探究Hyd-B对TAZ和TAK1的直接结合和相互作用的影响,采用co-IP法,如图3A的coIP结果可见,使用Ig G进行IP,Ctrl组和(包虫抗原B) Treat组中IB均未检测到TAZ蛋白的表达。而使用抗TAK1抗体进行IP,与Ctrl组相比,Treat组中IB检测到的TAZ表达水平较高(P<0.05)。如图3B,蛋白质印迹结果显示,与Ctrl组相比较,Treat组中细胞核TAZ表达水平较低(P<0.05),细胞质p-TAZ磷酸化水平较高(P<0.05),细胞质TAZ表达水平较低(P<0.05)。由此结果可知,Hyd-B抑制TAZ和TAK1的直接结合和相互作用。

图3 Hyd-B对TAZ和TAK1的直接结合和相互作用的影响

2.4过表达TAZ抑制Hyd-B促进BMSCs向破骨细胞分化的作用

为探究过表达TAZ对包虫抗原B促进BMSCs向破骨细胞分化作用的影响,蛋白质印迹法测定细胞中TAZ的表达水平,与OE vector组比较,TAZ OE组TAZ的表达水平升高(P<0.05)(图4A);与MCSF+RANKL+Hyd-B组比较,MCSF+RANKL+Hyd-B+TAZ OE组TRAP和Cathepsin K m RNA表达水平降低(P<0.05),MCSF+RANKL+Hyd-B+OE vector组无明显差异(P>0.05)(图4B);与MCSF+RANKL+Hyd-B组相比,MCSF+RANKL+Hyd-B+TAZ OE组细胞核转录因子p-P65和NFATc1表达水平降低(P<0.05),细胞质P65在各分组中的表达水平无显著差异(P>0.05);MCSF+RANKL+Hyd-B+OE vector组无明显差异(P>0.05)(图4C)。由此可知,过表达TAZ抑制Hyd-B促进BMSCs向破骨细胞分化。

图4过表达TAZ对包虫抗原B促进BMSCs向破骨细胞分化作用的影响

2.5过表达TAZ下调Hyd-B增强BMSCs中AKT/ERK1/2的活化水平

探究过表达TAZ对Hyd-B对BMSCs中AKT/ERK 1/2活化水平的影响,如图5所示,与MCSF+RANKL+Hyd-B组相比,MCSF+RANKL+Hyd-B+TAZ OE组p-ERK 1/2和p-AKT的磷酸化水平降低(P<0.05);MCSF+RANKL+Hyd-B+OE vector组无明显差异(P>0.05)。ERK 1/2和AKT的表达水平在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。由此结果可知,过表达TAZ下调Hyd-B增强BMSCs中AKT/ERK 1/2的活化水平。

图5过表达TAZ对包虫抗原B增强BMSCs中AKT/ERK 1/2活化水平的影响

3、讨论

破骨细胞是一种巨大的多核细胞,通过MCSF和RANKL从单核细胞/巨噬细胞谱系细胞分化而来[14]。NFATc1 (transcription factor nuclear factor of activated T cell 1,活化T-细胞核因子1)是破骨细胞分化的主要转录因子。它的活化是由NF-κB P65亚基向细胞核易位并转录NFATc1而上调表达和激活的[15]。TRAP、Cathepsin K和降钙素受体是破骨细胞分化标志物[16]。通过活化NF-κB/NFATc1信号,破骨细胞分化和发生可被增强[17]。NFATc1的表观遗传学修饰可增强其与Blimp1基因启动子的结合和下游破骨细胞前体分化相关基因的转录[18]。上述一系列研究结果证明了NFATc1以及调节NFATc1的活性对破骨细胞发生的重要性。MCSF+RANKL通过磷酸化激活细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK 1/2)和丝/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT),促进破骨细胞发生[19-20]。AKT磷酸化和活化能够促进NFATc1的核易位,增强其转录因子活性[21]。

骨溶解和骨侵蚀是骨CE的重要病理过程之一[11]。但是包虫感染通过何种机制进行骨溶解和骨侵蚀的,一直未有深入研究。先前对Hyd-B的具体功能知之甚少。只是检测包虫感染的血清学测定使用Hyd-B作为检测指标之一[22]。在本次研究结果中显示,Hyd-B能够联合促进MCSF+RANKL的作用,上调破骨细胞分化标志物TRAP、Cathepsin K m RNA的表达水平(图1),增强NF-κB P65磷酸化水平以及向细胞核的转位和磷酸化激活NFATc1。结果还显示Hyd-B能够增强ERK 1/2和AKT的磷酸化和活化水平(图2)。

RANKL结合肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6),通过激活TAK1/NF-κB/MAPK信号级联促进破骨细胞发生[23]。TAK1与TRAF6结合才能稳定TRAF6使其不被泛素化降解,从而活化NF-κB/NFATc1信号[24]。之前的研究表明,TAZ和YAP (Yes相关蛋白)作为转录共刺激分子,促进成骨相关细胞中成骨分化基因的表达和成骨发生[25]。成骨基因的表达和激活需要胞内Smad-1/5/8复合物与YAP/TAZ的结合和转位[26]。TAZ可能通过增强Smad-1/5/8和p38 MAPK的磷酸化水平促进成骨细胞分化[27]。最近研究又发现,TAZ可竞争性结合NFATc1,抑制NFATc1的去磷酸化和核转运,从而抑制破骨细胞发生[28]。在体过表达TAZ能够抑制双侧卵巢摘除术诱导的骨质疏松症小鼠模型骨量减少[29]。TAZ磷酸化后将通过泛素化被降解,从而解除对破骨细胞分化的抑制[28]。而TAK1可与TAZ直接结合并磷酸化TAZ,介导其降解[8]。因此,TAK1具有磷酸化抑制TAZ,促进破骨细胞发生的功能。在本次研究结果中显示,Hyd-B处理后的BMSCs将促进TAK1和TAZ的结合,以及TAZ的磷酸化(图3)。过表达TAZ将部分抵消Hyd-B对P65磷酸化和细胞核转位、NFATc1的细胞核转位以及ERK 1/2和AKT的磷酸化的促进作用(图4、5)。

综上所述,虽然在本研究中未建立骨包虫病动物模型来探讨上述分子是否在体内发挥骨侵蚀作用,这是本次研究的关键不足之处,然而细胞实验的结果显示,骨Hyd-B能抑制TAZ上调RANKL/NF-κB/TAK1介导的破骨细胞发生,这有助于加深对骨包虫病侵蚀宿主骨的病理机制的进一步理解与研究。

参考文献:

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[6]常玉山,杨来红,何雄,等.骨包虫病的影像学表现[J].中国CT和MRI杂志,2023,21(12):172-174.

[13]陈新华,温浩,卢晓梅,等.细粒棘球蚴重组抗原B的制备､纯化及鉴定[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2005,23(5):296-299.

基金资助:新疆维吾尔自治区自然科学基金(No.2021D01D19)~~;

文章来源:吾路汗·马汗,谢增如.包虫抗原B通过抑制TAZ促进RANKL/NF-κB/TAK1介导的破骨细胞发生[J].医学分子生物学杂志,2025,22(01):8-15.