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分析基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定丝状真菌的影响

2020-05-29 218 上传者：管理员

摘要：目的：评估菌株培养条件、培养天数以及结果判定截断值3种因素对基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定丝状真菌能力的影响。方法：将78株受试丝状真菌分别接种到沙堡弱葡萄糖琼脂、土豆葡萄糖琼脂两种培养基及28、35℃两种培养温度共4种组合的培养条件下进行培养,并于培养第2、3、4、5天以及第7天对其进行MALDI-TOFMS分析,根据鉴定率的差异筛选菌株MALDI-TOFMS鉴定用最佳培养条件和培养天数;下调MALDI-TOFMS结果：判定COV,分析其对MALDI-TOFMS丝状真菌鉴定率的影响。结果受试菌株在SDA和PDA两种培养基间的MALDI-TOFMS鉴定率无显著性差异(χ2=0.467,P=0.792),但28℃培养温度下的鉴定率高于35℃培养温度(χ2=7.195,P=0.027);培养第2、3天种水平(40.3%和34.3%)和属水平(44.8%和46.3%)鉴定率均较高;将MALDI-TOFMS种水平判定COV由>2.0下调至>1.7后,受试菌株种水平判定率显著提升(85.9%比32.1%,χ2=40.119,P<0.01)且不增加错误鉴定率。结论：丝状真菌以SDA或PDA培养基28℃培养2～3d,并以分值>1.7作为种水平判定COV,可有效提高MALDI-TOFMS对丝状真菌的鉴定能力。

关键词：
丝状真菌
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
影响因素
微生物
鉴定
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近年来,随着自身免疫病、艾滋病、肿瘤等恶性疾病患病率的不断攀升,曲霉等丝状真菌的临床感染率也在逐年升高[1,2,3]。丝状真菌种类繁多,不同菌种间耐药谱存在一定差异,如曲霉属中的土曲霉和构巢曲霉对抗真菌药两性霉素B天然耐药,焦曲霉和迟缓曲霉对两性霉素B及唑类药物灵敏度低;镰刀菌和接合菌对唑类及棘白菌素抗真菌药多不敏感[4,5,6,7]。因此,对丝状真菌分离株进行准确种属鉴定对于指导临床用药具有重要意义。尽管现阶段形态学方法仍是大多数微生物实验室进行丝状真菌分类鉴定的主要手段,但该方法存在耗时长、准确度低等局限性,且需要检验人员具有较高的专业知识水平及丰富的真菌鉴定经验。基因序列分析技术在微生物菌种鉴定方面具有较高的准确度,但费用、对操作人员及操作环境要求均较高,一定程度上限制了其在微生物实验室的常规开展与应用。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是新兴的微生物快速鉴定分析技术，检测成分主要为微生物胞内核糖体蛋白，经系统处理后得到与蛋白成分对应的质谱峰图，然后与数据库内包含菌株的参考质谱峰图进行比对，根据谱图相似程度对微生物进行菌种鉴定，现已成功应用于细菌及酵母菌菌种的鉴定且成效显著[8,9];MALDI-TOFMS也可用于曲霉等丝状真菌菌种鉴定，但其鉴定能力略逊，主要是由于曲霉等丝状真菌本身的复杂性以及现有数据库内丝状真菌菌种涵盖范围有限;另一方面，不同研究在受试菌株的培养条件、MALDI-TOFMS鉴定结果判定标准即截断值(cut-offvalue,COV)以及所选用的数据库等方面存在差别，致使其鉴定能力在不同研究中差异较大[10,11,12]。本研究拟对BrukerMALDI-TOFMS鉴定丝状真菌过程中涉及的灵活环节，即菌株的培养条件、培养时间以及结果判定COV进行评估，旨在优化BrukerMALDI-TOFMS鉴定丝状真菌的流程，提高整体鉴定能力。

1、材料与方法

1.1菌株

收集北京协和医院2016年10月至12月分离自临床患者送检标本的丝状真菌共计78株。全部菌株均经内转录间隔区以及钙调蛋白基因或转录延长因子1α基因序列分析实现准确种属鉴定[13,14],其中曲霉67株、镰刀菌7株、接合菌4株。

1.2主要仪器与试剂

Bruker Autoflex TMLTMALDI-TOFMS系统及丝状真菌数据库均购自德国布鲁克公司。真菌用沙堡弱葡萄糖琼脂和土豆葡萄糖琼脂培养基购自英国OXOID公司,甲酸溶液购自法国Sigma公司,乙腈溶液购自比利时ACROS公司,α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxy-cinnamicacid,HCCA)基质液购自德国布鲁克公司。

1.3具体操作

1.3.1菌株培养条件优化

将受试菌株以3点式方式接种于常用真菌培养基SDA和PDA各2个,分别放置于28℃真菌培养箱和35℃普通培养箱中进行培养,即SDA28℃、SDA35℃、PDA28℃、PDA35℃共4种培养条件。同一时段对上述4种培养条件下生长的菌落进行MALDI-TOFMS鉴定,根据鉴定率差异筛选丝状真菌MALDI-TOFMS鉴定用最佳培养条件。

1.3.2培养天数优化

在确定受试菌株MALDI-TOFMS鉴定用最佳培养条件后,对该条件下培养第2、3、4、5天以及第7天的菌落分别进行MALDI-TOFMS鉴定,比较不同培养天数在丝状真菌MALDI-TOFMS鉴定率上的差异,筛选最佳培养天数。

1.3.3MALDI-TOFMS鉴定

采用标准甲酸-乙腈提取法对受试菌株进行分析前处理,具体步骤为:生物安全柜内无菌接种环刮取目的菌落外围较新鲜菌丝成分适量至300μl灭菌水中(图1),加入900μl无水乙醇,混匀,静置5min;室温条件下12000rpm离心3min,弃上清;50～80μl70%甲酸溶液重悬菌体沉淀,室温放置5～10min,以利于甲酸充分发挥破壁作用;然后加入等量乙腈溶液,混匀,室温放置5～10min。短暂离心后吸取1μl离心上清点样于BrukerMSP384靶板,干燥后覆盖1μlHCCA基质液;完全干燥后放入Bruker Autoflex TM LTMALDI-TOFMS仪器机舱进行检测,检测参数参照Bruker用户手册,分析数据库选用Bruker官方丝状真菌数据库(v1.0)。对MALDI-TOFMS鉴定结果的判读采用Bruker推荐的COV,即判定分值>2.0可实现种水平鉴定、判定分值为1.7～2.0可实现属水平鉴定,判定分值<1.7则无法实现鉴定。

图1MALDI-TOFMS鉴定丝状真菌的菌落取材部位(A,方框)和取材量(B)

1.3.4调整MALDI-TOFMS判定COV

下调MALDI-TOFMS鉴定结果判读标准,将种水平判定COV由>2.0下调至>1.7,属水平判定COV由1.7～2.0下调至1.4～1.7,判定分值<1.4则无法实现鉴定。分别采用Bruker推荐的COV和调整后的COV判读受试菌株MALDI-TOFMS鉴定结果,分析标准COV和调整后COV在MALDI-TOFMS丝状真菌鉴定率上的差异。

1.4统计学处理

采用SPSS19.0软件进行统计学分析,计数资料用频数(百分数)表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.14种菌株培养条件对丝状真菌鉴定结果的影响

BrukerMALDI-TOFMS对78株受试丝状真菌的种水平鉴定率在4种培养条件下为17.9%(14/78)至28.2%(22/78)不等,属水平鉴定率为43.6%(34/78)至51.3%(40/78)不等(表1),整体鉴定率在4种培养条件间差异并不显著(χ2=6.997,P=0.321)。进一步分析显示,MALDI-TOFMS对丝状真菌的鉴定率在SDA和PDA两种培养基间无显著性差异(χ2=0.467,P=0.792),但28℃培养温度下的整体鉴定率均高于35℃(χ2=7.195,P=0.027)。

表1菌株培养条件对MALDI-TOFMS鉴定丝状真菌能力的影响[n(%)]

2.2培养天数对丝状真菌鉴定结果的影响

以受试菌株SDA28℃培养条件为基础,分别于培养第2、3、4、5天和第7天对目的菌落取材进行MALDI-TOFMS鉴定,不同培养天数下得到的MALDI-TOFMS鉴定率存在显著性差异(χ2=139.032,P<0.01),其中培养第2、3天种水平(40.3%和34.3%)和属水平(44.8%和46.3%)鉴定率均较高;随着培养天数延长,受试菌株的MALDI-TOFMS种水平和属水平鉴定率均呈现下降趋势,这一现象在快速生长接合菌中尤为突出。培养至第7天,MALDI-TOFMS对受试菌株已无法实现种水平鉴定,仅14.1%(11/78)菌株可实现属水平鉴定(表2)。

表2培养天数对MALDI-TOFMS鉴定丝状真菌能力的影响[n(%)]

2.3结果判定截断值对丝状真菌鉴定结果的影响

以受试菌株SDA28℃培养3d的MALDI-TOFMS鉴定结果为基础,分别采用Bruker推荐的COV和调整后的COV对鉴定结果进行分析判读。其中,将种水平判定COV由>2.0下调至>1.7后,受试菌株种水平鉴定率由32.1%(25/78)显著提升至85.9%(67/78)(χ2=40.119,P<0.01);另一方面,虽然下调COV后导致受试菌株的种水平鉴定错误例数从2例增加至5例,但错误鉴定率为7.5%(5/67),较标准COV情况下的8%(2/25)未无升高。将属水平判定COV从1.7～2.0下调至1.4～1.7后,并未导致属水平错误鉴定情况的发生。下调COV后,无法鉴定例数由11例(14.1%)降至2例(2.6%),仅1株烟曲霉和1株黑曲霉因其MALDI-TOFMS判定分值<1.4而无法实现属水平鉴定(表3)。

表3结果判定截断值对MALDI-TOFMS丝状真菌鉴定能力的影响[n(%)]

3、讨论

本研究显示,受试菌株在SDA和PDA两种培养基间的MALDI-TOFMS鉴定率无显著性差异,但28℃培养温度下的鉴定率高于35℃(χ2=7.195,P=0.027);培养第2、3天种水平(40.3%和34.3%)和属水平(44.8%和46.3%)鉴定率均较高;将MALDI-TOFMS种水平判定COV由>2.0下调至>1.7后,受试菌株种水平判定率显著提升(85.9%比32.1%,χ2=40.119,P<0.01)且不增加错误鉴定率。

本研究共收集78株丝状真菌临床分离株,菌种分布情况基本可覆盖临床常见丝状真菌。分别从受试菌株培养条件和培养天数评估其对MALDI-TOFMS鉴定率的影响,其中不同培养基间得到的MALDI-TOFMS丝状真菌鉴定力无显著性差异,但培养温度以28℃为佳,此时得到的种水平鉴定率较35℃条件下高出10%。就受试菌株培养天数而言,随着天数延长,MALDI-TOFMS对受试菌株的种水平及属水平鉴定率均呈显著下降趋势。究其原因,可能与本研究采用BrukerMALDI-TOFMS商业丝状真菌数据库,该数据库的建库谱图均是基于丝状真菌液体培养后收集菌丝体进行MALDI-TOFMS分析获得有关,然而液体培养法在国内大多数真菌实验室并未开展。前期有研究表明,曲霉等丝状真菌的孢子成分和菌丝成分在MALDI-TOFMS峰图上存在差异[15],导致这一现象的原因可能为二者处于不同的生物阶段,且二者细胞结构不同。35℃培养条件更利于曲霉等丝状真菌产孢而28℃适合丝状真菌菌丝体生长,且无论在何种培养温度下,随着培养天数延长,丝状真菌产孢更加丰富,菌丝体的生长则相应减缓,培养2～3d的菌落较易获得菌丝体成分,而培养4～5d的菌落表面覆盖大量孢子粉,很难取到单纯菌丝成分。为了更好地利用Bruker丝状真菌数据库,建议以SDA或PDA28℃培养2～3d的新鲜稚嫩丝状真菌菌落进行MALDI-TOFMS鉴定。

继往有研究表明,BrukerMALDI-TOFMS推荐的COV标准针对丝状真菌鉴定略为苛刻,致使菌株种水平鉴定率不高。本研究中,采用Bruker推荐COV时,仅32.1%(25/78)受试菌株因判定分值>2.0而得到了种水平鉴定。若舍弃判定分值这一因素,单纯将菌株MALDI-TOFMS鉴定结果与测序鉴定结果进行比较,发现绝大多数经BrukerMALDI-TOFMS仅实现属水平鉴定的菌株其鉴定结果在种水平亦正确;部分经Bruker无法实现鉴定的菌株实则在属水平鉴定正确。这一现象在多个相关研究中已有发现,研究人员多通过调整COV标准将这一部分菌株的鉴定结果予以归正[10,11,12]。本研究分别对种水平和属水平COV进行下调,其中种水平COV由分值>2.0降至>1.7,属水平COV调整至1.4～1.7,通过与Bruker推荐的COV进行比较,下调COV后,受试丝状真菌的种水平鉴定率由32.1%显著提升至85.9%,但种水平错误鉴定率较标准COV未升高,且错误鉴定情况均发生在同一属内进化关系较近的菌种,如隶属于黄曲霉复合群中的黄曲霉和米曲霉,有研究表明对于二者的鉴别区分需通过分子测序手段[16]。下调COV后并未导致受试菌株MALDI-TOFMS属水平错误鉴定情况的发生。

综上所述,以BrukerMALDI-TOFMS及其商业丝状真菌数据库为基础,以SDA或PDA28℃培养2～3d并对菌落进行分析,以分值>1.7作为种水平判定COV,可有效提高BrukerMALDI-TOFMS对丝状真菌的鉴定能力。

参考文献：

[13]李颖,徐英春.评价ITS､BenA和CaM序列分析在曲霉菌种鉴定方面的应用[J].中国真菌学杂志,2017,12:74-77.

[14]李颖,郭莉娜,徐英春.内转录间隔区(ITS)序列分析技术对丝状真菌临床分离株鉴定能力的评估[J].中华微生物学和免疫学杂志,2017,37:607-610.

李颖,张戈,杨洋,李冬雪,王贺,徐英春.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定丝状真菌的影响因素分析[J].协和医学杂志,2020,11(02):156-161.