研究建立碘甘油微生物计数法检查的方法

2020-04-11 500 上传者：管理员

摘要：目的：研究碘甘油微生物计数法检查的方法。方法：根据《中国药典》2015年版规定，用薄膜过滤法测定5种试验菌株的回收率来进行方法适用性试验。结果：微生物计数法检查的方法适用性试验中,各试验菌株的回收率均在50%～200%范围内，符合药典规定。结论：经研究碘甘油可以用薄膜过滤法进行微生物计数法检查。

关键词：
微生物
碘甘油
薄膜过滤法
计数法检查
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碘甘油是口腔科常用非处方药，剂型为涂剂，主成分为碘，辅料为碘化钾，甘油，具有消炎、防腐、收敛等作用，其作用机制是使菌体蛋白质变性、死亡，对细菌、真菌、病毒均有杀灭作用，常用于口腔粘膜溃疡、牙龈炎及冠周炎等疾病。

微生物污染会使药品变质，从而给服药者带来疾病甚至威胁生命。微生物计数检查用来测定药品受污染的程度，是评价药品安全性的重要指标。根据《中国药典》2015年版四部通则1107非无菌药品微生物限度标准规定，碘甘油应进行微生物计数法检查，包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。但在检查之前，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于此项检查。因为本品具有抗菌活性，所以，本文参考相关文献[1-4],在符合规定的洁净实验室，严格遵守无菌操作要求，多次进行适用性试验研究,确定采用薄膜过滤法对本品进行微生物计数法检查。

1、材料

1.1 试验菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，5种试验菌株均购自中国食品药品检定研究院，使用第四代培养物。

1.2 试剂及培养基

pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液、聚山梨酯80、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基，均购自中国食品药品检定研究院，并且均在验证合格的灭菌程序下灭菌，培养基适用性试验也均符合药典要求。

1.3 供试品

碘甘油，由上海运佳黄浦制药有限公司生产，批号：180504，规格：1%。

1.4 仪器

电子天平，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，微生物检测隔膜泵及过滤支架。

2、方法与结果

2.1 菌液制备

取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨液体培养物，分别用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液备用。取经25℃培养2～3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液备用。取经25℃培养7天的黑曲霉菌沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入5mL含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱，然后用管口带薄无菌纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管吸出孢子悬液置无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液备用。

2.2 供试液制备

取供试品10mL，加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100mL，使之分散均匀，制成1：10的供试液。

2.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数法（薄膜过滤法）回收率的测定

（1）试验组：取供试液1mL加pH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液100mL混匀，薄膜过滤，每次100mL，冲洗6次，在最后1次冲洗液中加入1mL含菌量不大于100cfu／mL菌液冲洗过滤，将滤膜菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂平板（需氧菌总数计数）和沙氏葡萄糖琼脂平板（霉菌和酵母菌总数计数）上。在规定条件（需氧菌总数计数法培养温度为35℃，细菌培养3天，霉菌和酵母菌培养5天；霉菌和酵母菌总数计数法细菌培养温度为25℃，培养时间5天）下培养，观察结果。

（2）供试品对照组：取供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

（3）菌液对照组：取稀释液替代供试液，同试验组操作。

以上各组均同时做阴性、空白对照试验。计算试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值，各试验菌的回收试验结果均在0.5～2范围内，说明本法适合于该品种的微生物计数法检查。结果见表1。

表1 各试验菌株的回收率(％)

3、结论

（1）综上所述，碘甘油的微生物计数法检查采用薄膜过滤法进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。

（2）药品的微生物计数法检查是评价药品质量安全性的重要一环，受试验环境、试剂、方法等因素的影响很多，应进行方法适用性试验研究，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物计数法检查。

（3）《中国药典》2015年版对药品微生物计数法检查做了很大改变，方法适用性试验更加科学、合理，对于碘甘油，用薄膜过滤法来去除其抗菌活性，能更好地减少使用中和剂或灭活剂带来的污染；同时，采用适宜的冲洗量来冲洗滤膜，既消除了本品对微生物生长的影响，又防止了较大冲洗量对滤膜的破坏。因此，本文为同类研究提供了有益的参考。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药2015年版四部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:140-151.

[2]林春养.碘甘油对口腔溃疡的治疗效果[J].海峡药学,2018,(10).

[3]江志杰,张光华,李斐菲,郭青苇.氟比洛芬微生物计数方法适用性研究[J].首都食品与医药,2019,(08).

[4]陈洁,周剑.盐酸小檗碱片微生物限度适用性试验验证[J].现代医药卫生,2017,(12).

毛艳华,张震.碘甘油微生物计数法检查的方法适用性研究[J].全科口腔医学杂志(电子版),2020,7(1):154,172.