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布鲁氏菌 T4SS 15个效应蛋白的生物信息学分析

2024-07-15 101 上传者：管理员

摘要：目的对布鲁氏菌T4SS 15个效应蛋白进行生物信息学分析。方法从NCBI数据库中获取布鲁氏菌T4SS的15个效应蛋白的氨基酸序列，利用生物信息学软件分析15个效应蛋白的理化性质及同源建模分析跨膜区、信号肽、亲水性、保守结构域、B细胞抗原表位、T细胞抗原表位、抗原性、翻译后修饰位点及效应蛋白间的相互作用等。结果 15个布鲁氏菌T4SS效应蛋白主要为无信号肽和跨膜螺旋结构的亲水性蛋白，其中BspB有跨膜螺旋结构和信号肽、RicA、BspA、BPE005和BPE275疏水性蛋白；除VceC、BspB、BspC、BspE和BPE123外其余11个效应蛋白均具有1个或多个稳定结构域；BPE043有优势B细胞抗原表位且CD4 T细胞抗原表位数量较高；修饰化位点预测显示：15个效应蛋白中有12个同时具有糖基化、甲基化、磷酸化、乙酰化修饰位点；对效应蛋白互作预测分析显示BPE043可同时与VceC、BspE、BspF蛋白发生互作，其余11种效应蛋白间发生互作的概率较低。结论 BPE043蛋白抗原性较强，可作为布鲁氏菌潜在的疫苗候选基因，为布鲁氏菌T4SS效应蛋白生物学功能研究提供科学依据。

关键词：
T4SS
人体健康
全身乏力
布鲁氏菌
生物信息学分析
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布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)感染所致的世界范围内广泛流行的一种人畜共患病,严重危害人体健康和畜牧业的发展[1]。布鲁氏菌主要侵袭的对象有羊、牛、猪,引起怀孕母畜的流产,还能破坏雄性动物生殖系统从而导致不育[2]。而人感染布鲁氏菌主要症状表现为慢性持续性感染,临床表现为波状热、全身乏力、多汗及关节部位的肿痛等症状[3]。

布鲁氏菌IV型分泌系统(Type IV secretion system,T4SS)是布鲁氏菌重要的毒力因子,布鲁氏菌T4SS能够通过调节宿主细胞的信号通路在内质网中建立复制位点,从而抑制宿主的免疫应答,形成慢性感染[4,5]。T4SS主要通过分泌效应蛋白作用于宿主细胞发挥其生物学功能[6],而效应蛋白依赖于T4SS分泌[7]。通过瞬变电磁法瞬变电磁(Timedomain electromagnetic method,TEM)法,目前共鉴定出布鲁氏菌T4SS效应蛋白15个[8],其中大多数效应蛋白的功能、作用机制、及其作用靶标等尚不清楚。因此,开展效应蛋白的生物信息学预测分析,对于研究布鲁氏菌T4SS效应蛋白的生物学功能挖掘具有重要意义。

1、材料与方法

1研究对象

根据GenBank上公布的布鲁氏菌2308 T4SS分泌的效应蛋白的信息下载基因序列及氨基酸序列，目前被证实的15个效应蛋白NCBI登录号见表1。

表1布鲁氏菌T4SS效应蛋白序列相关信息

2方法

2.1布鲁氏菌T4SS效应蛋白的理化性质及同源建模分析

利用SMS和Expasy软件预测布鲁氏菌T4SS分泌的15种效应蛋白的蛋白分子质量、等电点和稳定性进行分析；通过SWISS-MODEL软件对15种效应蛋白的结构模型进行预测。

2.2布鲁氏菌T4SS效应蛋白跨膜区、信号肽和亲水性预测

通过TMHMM Server v.2.0、SignalP4.1 Server和Prot scale软件预测布鲁氏菌T4SS分泌的15种效应蛋白的跨膜区、信号肽及亲、疏水性。

2.3布鲁氏菌T4SS效应蛋白的核信号预测

利用cNLS Mapper软件对布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白进行核信号预测。

2.4布鲁氏菌T4SS效应蛋白的保守结构域预测

通过NCBI CD-Search在线软件对布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白的保守结构域进行预测。

2.5布鲁氏菌T4SS效应蛋白的B、T细胞抗原表位及抗原性和抗原肽进行预测

使用IEDB来预测布鲁氏菌T4SS分泌的效应子的T细胞表位；使用SVM trip软件来预测布鲁氏菌T4SS分泌的效应子的B细胞表位；运用Vaxijen v2.0、Predicting Antigenic Peptides软件预测15个效应蛋白的抗原性和抗原肽。

2.6布鲁氏菌T4SS效应蛋白的翻译后修饰位点预测分析

应用iRice-MS软件对布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白进行乙酰化位点预测；利用NetPhos 3.1 Server软件对布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白进行磷酸化位点预测；通过GlycoMine软件对布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白进行糖基化修饰位点预测；应用SRAMP软件对布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白甲基化修饰位点进行预测。

2.7布鲁氏菌T4SS效应蛋白的相互作用预测

通过STRING软件预测布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白之间的相互作用。

2、结果

1布鲁氏菌T4SS相关效应蛋白的理化性质及同源建模分析

利用SMS和Expasy软件预测布鲁氏菌T4SS分泌的15种效应蛋白的蛋白分子质量、理论等电点和不稳定系数，结果显示，RicA、VceA、BspC、BtpB、SepA和BPE043为稳定蛋白，其余9种效应蛋白不稳定系数>40,为不稳定白；通过SWISS-MODEL软件对15种效应蛋白的结构模型进预测，。结果显示，有14种效应蛋白同源模型成功建立，效应蛋白BPE043未成功构建模型(表2,图1)。

表2 15种效应蛋白的蛋白分子质量、等电点和不稳定系数预测

图1效应蛋白的模式图预测

2布鲁氏菌T4SS相关效应因子的跨膜结构、信号肽及亲疏水性分析

通过TMHMM Server v.2.0、SignalP4.1 Server和ProtScale软件在线软件分析预测其跨膜区、信号肽及亲水性分析。结果表明1个蛋白(BspB)有跨膜螺旋结构和信号肽；有4个蛋白(VceC,BspA,BPE043,BPE275)有跨膜螺旋结构但无信号肽，有2个蛋白(VceA、BspC)无跨膜螺旋结构但有信号肽；其余8个蛋白(RicA、BspE、BspF、BtpA、BtpB、SepA、BPE005、BPE123)无跨膜螺旋结构也不存在信号肽。ProtScale预测出15个T4SS相关效应蛋白中除RicA、BspA、BPE005和BPE275外均为亲水性蛋白(表3)。

表3 15种效应蛋白的跨膜螺旋结构、信号肽及亲水性平均系数预测

3布鲁氏菌T4SS效应蛋白的核信号预测

通过cNLS Mapper软件对布鲁氏菌T4SS 15种效应蛋白进行核信号预测发现有9个蛋白预测出核信号，得分为3～5.9(表4)。

表4 9种效应蛋白的核信号预测

4布鲁氏菌T4SS相关效应因子的保守结构域预测

通过NCBI CD-Search在线软件预测布鲁氏菌T4SS相关效应蛋白的保守结构域，布鲁氏菌T4SS相关效应蛋白中除VceC、BspB、BspC、BspE和BPE123外其余11个效应蛋白(RicA、VceA、BspA、BspE、BspF、BtpA、BtpB、BPE005、BPE043、BPE275)均具有1一个或多个稳定结构域(表5)。

5布鲁氏菌T4SS相关效应蛋白的B、T细胞抗原表位和抗原性及抗原肽预测

布鲁氏菌T4SS 15个相关效应蛋白中有1个蛋白(BPE043)有优势B细胞抗原表位且CD4 T细胞抗原表位48个，结合抗原性和抗原肽数量，预测其可能具有较强的抗原性。RicA、VceA、BspB、BspE、SepA CD4 T细胞抗原表位数量较少(数量<5);其中BspE未预测出B细胞抗原表位(表6和7,图2)。

6布鲁氏菌T4SS相关效应蛋白翻译后修饰位点的预测

通过GlycoMine在线软件对布鲁氏菌T4SS相关效应蛋白进行糖基化修饰位点预测，15个效应蛋白可能在信号通路中起调控作用，布鲁氏菌T4SS效应蛋白均有磷酸化位点和糖基化位点；除BspA、BPE005和BPE123这3个效应蛋白外，其余12个效应蛋白均具有甲基化位点(表8)。

表5 11种效应蛋白的结构域预测

图2 T4SS效应蛋白抗原肽预测

7布鲁氏菌T4SS相关效应因子的相互作用预测

通过STRING在线软件预测布鲁氏菌T4SS相关效应蛋白之间的相互作用，除BPE043可与VceC、BspF、BspE产生互作外，其余蛋白内部之间不存在互作关系。相关效应蛋白中10个蛋白(RicA、VceA、VceC、BspA、BspE、BspF、BtpB、BPE005、BPE043、BPE275)可与其他蛋白发生互作；但其余5种蛋白(BspB、BspC、BtpA、SepA、BPE123)在预测中未发现与之互作蛋白(表9,图3)。

表6 15种效应蛋白T细胞表位的预测

表7 SVM trip软件预测15种效应蛋白B细胞表位

图3 T4SS效应蛋白间的互作预测

表8 15种效应蛋白抗原性和抗原肽数量预测

表9 15种效应蛋白的修饰化位点预测

3、讨论

布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白是布鲁氏菌发挥致病性的关键，在布鲁氏菌的胞内生存和增殖中发挥着重要作用。目前被证实的布鲁氏菌效应蛋白有15种，VceA和VceC是最早鉴定出的布鲁氏菌T4SS的效应蛋白[9]。研究发现，布鲁氏菌可通过T4SS分泌的效应蛋白参与调控宿主细胞内抗感染过程，RicA可与人蛋白Rab2GTpase相互作用，在Hela细胞感染试验中被证实其影响BCV的成熟，且RicA缺失株使布鲁氏菌的胞内增殖更快[10,11]。从20个候选蛋白中确认BspA、BspB、BspC、BspF、BspE的分泌均也依赖于IV型分泌系统[12],且布鲁氏菌效应蛋白BspA、BspB、BspF能够抑制宿主细胞中某些蛋白的分泌通路但其具体作用的机制尚不明确，发现BspB与巨噬细胞的分泌蛋白有共同特性[13],本研究中预测出BspB效应蛋白是一种同时具有B细胞表位、T细胞表位、抗原性较高、具有多条抗原肽、有多个蛋白修饰位点的亲水性蛋白，推测其可以逃避巨噬细胞的杀伤，多个修饰位点表明该蛋白可通过翻译后修饰，被赋予多样化的功能，能够影响布鲁氏菌在机体内的复制和生存。

BtpA在感染早期可转位于宿主胞内，干扰宿主Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)信号[6],导致树突状细胞(dendritic cells, DC)成熟减少，进而抑制促炎细胞因子的分泌和影响NF-κB信号通路的激活[14,15],该过程对促进布鲁氏菌胞内感染，建立慢性感染阶段尤为重要，本研究预测显示出T4SS效应蛋白具有Toll样受体结构域。而BPE123、BPE005、BPE275和BPE043作为T4SS分泌底物[16,17],在进化上具有高度保守性，王书利等[18]研究发现BPE123基因的缺失不影响布鲁氏菌的体外生长，但影响布鲁氏菌的胞内寄生能力；BPE043和BPE123可通过影响细胞自噬进而影响布鲁氏菌的胞内生存[19];通过在线软件预测出BPE043为布鲁氏菌的优势抗原，定位于细胞核和细胞质中，同时具有多个修饰位点，且预测出其能够与VceC、BspF、BspE发生互作。此外，罗文博等[20]研究进一步证实BPE043基因的缺失能够显著降低布鲁氏菌的毒力，能够推测出BPE043可作为布鲁氏菌潜在的疫苗候选基因。

综上所述，通过对15个布鲁氏菌T4SS分泌的效应蛋白稳定性、跨膜区、信号肽、亲、疏水性及免疫原性等生物信息学分析预测，发现BPE043可作为布鲁氏菌的候选亚单位疫苗，为布鲁氏菌T4SS效应蛋白的后续研究及新型疫苗和诊断技术的研发提供科学依据。

参考文献:

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[19]罗文博.布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BPE123和BPE043的生物学功能初步研究[D].合肥:安徽医科大学,2020.