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泉州地区希特林蛋白缺乏症患儿SLC25A13基因突变谱分析

2024-09-12 67 上传者：管理员

摘要：目的了解泉州地区希特林蛋白缺乏症患儿SLC25A13基因突变谱情况。方法 2014年1月1日—2021年11月1日应用高效液相色谱-串联质谱法在576 601名新生儿中筛查希特林蛋白缺乏症患儿，新生儿或婴儿期发病的新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD)是最主要的儿科表型，结合MassArray技术、二代测序法及Sanger测序法对SLC25A13致病基因突变进行分析，寻找可能的致病突变位点，分析泉州地区SLC25A13的基因突变谱、热点突变。结果 20例NICCD患儿中共发现7种突变，包括c.851＿854delGTAT(42.1%)、IVS6+5G>A(26.3%)、c.1638＿1660dup(13.2%)、IVS16ins3kb (10.5%)、c.1095delT(2.6%)、c.1399C>T(2.6%)、IVS6-11A>G(2.6%),热点突变为c.851＿854delGTAT、IVS6+5G>A、c.1638＿1660dup、IVS16ins3kb,共占92.1%,其中IVS6-11A>G为新突变。共发现10种基因型，其中c.851＿854delGTAT/IVS6+5G>A基因型比例最高，占36.8%。结论通过对泉州地区20例希特林蛋白缺乏症患儿的基因结果进行分析，研究了泉州地区SLC25A13致病基因的基因突变谱，整理了热点突变。

关键词：
SLC25A13基因
基因突变
希特林蛋白缺乏症
线粒体内钙结合
隐性遗传疾病
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希特林蛋白缺乏症是由于线粒体内钙结合的天冬氨酸/谷氨酸载体蛋白Citrin缺乏所致的常染色体隐性遗传疾病[1],包含3种年龄依赖性的临床表现型，分别是新生儿或婴儿期发病的新生儿肝内胆汁淤积症(NICCD,OMIM 605814)、较大儿童发病的生长发育落后和血脂异常(FTTDCD)以及青春期或成人期发病的成年发作瓜氨酸血症Ⅱ型(CTLN2,OMIM 603471)[2-3]。其中，NICCD是希特林蛋白缺乏症最主要的儿科表型，主要表现为黄疸、肝大、肝功能异常，常伴有低蛋白血症、凝血功能低下、溶血性贫血、低血糖等[4]。大多数NICCD患儿的临床症状及体征可在1岁左右自然消失或经过饮食结构调整和药物对症治疗恢复到相对健康的状态，但有个别患儿因感染或肝硬化等严重并发症而预后不良[5]。目前，NICCD的发病机制尚不完全清楚，缺乏临床或生化诊断标准，而SLC25A13基因分析被认为是确诊NICCD的可靠手段[6]。本研究旨在分析20例NICCD患儿的基因检测结果，研究泉州地区SLC25A13的基因突变谱及热点突变。

1、对象与方法

1.1研究对象

2014年1月1日—2021年11月1日泉州市新生儿疾病筛查分中心共筛查了576 601名新生儿(男性新生儿325 604名，女性新生儿250 997名，男∶女=1.30∶1),经临床诊断发现20例NICCD患儿。健康新生儿出生72 h充分哺乳后在知情同意前提下采集足跟血，制成Whatman 903滤纸干血斑，5个工作日内检测；早产儿、低出生体质量儿及正在治疗疾病的新生儿，采血时间不超过出生后30 d。所有样本的采集和检测均经泉州市儿童医院伦理委员会批准，并在监护人签署知情同意书的情况下完成。

1.2方法

1.2.1串联质谱法筛查NICCD患儿

采集新生儿足跟血，滴于903特殊滤纸片上自然阴干，密封袋密封后2℃～8℃保存，5个工作日内检测。取直径3 mm干血滤纸片置于96孔板中，按照非衍生化法筛查试剂盒的使用说明书提取血斑中的氨基酸，通过高效液相色谱-串联质谱法检测11种氨基酸的浓度。以0.5%～99.5%的置信区间为正常参考范围，瓜氨酸浓度在1～2倍截断值的判为弱阳性，>2倍截断值的判为阳性。初次筛查结果判为弱阳性，召回复查时瓜氨酸浓度仍大于截断值的患儿判为阳性。新生儿筛查共发现153例新生儿瓜氨酸浓度大于截断值，对筛查阳性的患儿立即召回，进行血氨、血气、乳酸、血糖、总胆汁酸、甲胎蛋白、凝血功能、生化、尿有机酸分析等相关检查，并进行基因突变检测。阴性者纳入常规儿童保健。

1.2.2突变位点检测

1.2.2.1 MassArray技术

利用Qiagen Blood DNA mini kit提取基因组DNA,采用杭州博圣医学实验室有限公司的希特林蛋白缺乏症MassArray套餐检测SLC25A13基因的16个突变位点。依次进行多重PCR扩增、SAP反应以及单一碱基延伸反应，延伸产物经纯化后，应用Agena RS1000芯片点样仪将最终反应产物点到芯片上，利用美国公司的激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS,Agena Bioscience)对样本进行检测，并使用配套软件TYPER 4.0进行结果分析。

1.2.2.2二代测序法

采用ASS1、ASL、SLC25A13、SLC25A15、CPS1、OTC、NAGS、ARG1、PAH、PTS等86个遗传代谢病相关基因的捕获探针，通过多重探针杂交方法靶向富集目标区域序列，文库精确定量后在HiSeq 2500(Illumina)平台测序。将高通量基因靶向测序数据进行低质量过滤，用BWA序列比对方法将通过质控的序列比对到人类基因组参考序列；采用GATK识别目标序列中的突变位点，采用Annovar注释软件将突变位点注释到公共突变数据库，根据突变位点在正常人群中的频率、序列保守性、突变引起的氨基酸改变以及在蛋白质结构中所处的位置，预测突变对蛋白功能的影响程度；根据ACMG标准与指南对突变进行致病性解读。通过MassArray技术、二代测序法对筛查阳性的患儿进行相关致病基因的突变分析，获得可疑的突变位点。对检出致病突变位点的患儿，采集父母的手指末梢血滴于采血滤纸片上(4滴)或外周血2 ml(EDTA抗凝)进行Sanger测序验证以确定变异来源。

2、结果

2.1串联质谱法筛查结果

利用串联质谱法对576 601名新生儿进行相关遗传代谢病的筛查，共发现153例新生儿瓜氨酸浓度大于截断值，初筛阳性率为0.027%,其中确诊17例NICCD患儿(男10例，女7例，男∶女=1.43∶1)。另外，2例因在出生后3 d的串联质谱筛查结果瓜氨酸浓度在参考范围内而漏筛，后来分别因肝功能异常和黄疸迁延不退来医院门诊就诊而确诊；1例出生后3 d未参加串联质谱筛查，后因家系分析而确诊。共确诊20例NICCD患儿，男12例，女8例，男∶女1.5∶1,瓜氨酸浓度15.75～224.92μmol/L,平均值为108.96μmol/L,中位数为104.26μmol/L。确诊年龄以基因报告时间为截点，平均为3.98个月(0.5～32个月，中位数为2个月)。20例患儿中，13例患儿进行尿有机酸分析检查，其中7例发现4-羟基苯乳酸或4-羟基苯丙酮酸等特异性指标异常升高，5例未发现遗传代谢疾病特异性指标改变，1例发现非特异性指标异丁酰甘氨酸浓度轻度升高。

2.2临床表型

20例NICCD患儿中，17例通过新生儿串联质谱筛查发现，2例分别因肝功能异常或持续性黄疸而确诊，1例通过先证者的家系研究而确诊。NICCD多于0～1岁发病，主要表现为生长发育迟缓、胆汁淤积性黄疸、新生儿肝炎等，多以迟发、复发或者迁延性黄疸就诊，大多数患儿上述症状及体征在1岁内可自然消失或经过饮食结构调整和药物对症治疗缓解，个别患者因感染或肝硬化等并发症而预后不良。临床表现为胆汁淤积、黄疸迁延、肝功能异常的患儿应警惕NICCD可能，尽早进行血氨基酸谱分析及SLC25A13基因突变分析，及时确诊有助于患儿的饮食治疗管理和对症处理。

2.3 SLC25A13基因突变分析结果

20例患儿的SLC25A13基因检测结果见表1。

表120例患儿的SLC25A13基因检测结果

同一个家庭的两例患儿(例12及例13)含有同样的突变，因此在计算突变类型及基因型频率时，该家庭只计算1例患儿的SLC25A13等位基因，共发现10种基因型，16例为复合杂合突变，3例为纯合突变，其中2例为c.851_854delGTAT/c.851_854delGTAT纯合突变，1例为IVS6+5G>A/IVS6+5G>A纯合突变。16例复合杂合突变的NICCD患儿中，12例携带c.851_854delGTAT基因突变，其中7例为c.851_854delGTAT/IVS6+5G>A复合杂合突变，c.851_854delGTAT/IVS6+5G>A基因型的比例最高，为36.8%(7/19)。

本研究共检出6种已报道致病性突变和1种临床意义未明突变(IVS6-11A>G),包括2种小片段缺失突变(c.851_854delGTAT,42.1%;c.1095delT,2.6%),2种剪接部位突变(IVS6+5G>A,26.3%;IVS6-11A>G,2.6%),1种重复突变(c.1638_1660dup, 13.2%),1种大片段插入(IVS16ins3kb, 10.5%),1种无义突变(c.1399C>T,2.6%)。其中，c.851_854delGTAT,IVS6+5G>A,c.1638_1660dup和IVS16ins3kb这4种突变共占92.1%,构成了泉州地区SLC25A13基因的高频突变。c.851_854delGTAT是最常见的突变类型。

3、讨论

1999年，Kobayashi等通过对CTLN2病例标本采用纯合性作图和定位克隆的方法，发现了引起CTLN2的致病基因SLC25A13。SLC25A13作为希特林蛋白缺乏症的致病基因，位于染色体7q21.3,含18个外显子，长度约为200 kb[7]。目前已发现的SLC25A13突变类型已达100多种[8],大多数为编码序列突变(包括错义、无义和同义突变以及小片段插入、缺失突变),其次为剪接部位突变，少数突变为涉及内含子序列的大片段插入/缺失。日本、韩国、中国健康人群中SLC25A13基因突变携带率分别为1/69、1/112、1/65[9-10]。中国不同地区SLC25A13基因的突变形式和频率有很大区别，南方人群的基因突变携带率明显高于北方人群，其中南方人群基因变异携带率为1/48,高于中国北方人群的1/940。因此，在南方地区筛查NICCD患儿，并对SLC25A13的基因突变类型和频率进行分析是十分必要的。

2007年，Saheki团队对75例NICCD患儿进行基因突变分析，发现2个高频突变c.852_855delTATG和IVS11+1G>A[11]。2017年，赵正言团队也对浙江省确诊的29例NICCD患儿进行基因突变分析，得出SLC25A13的热点突变为c.852_855delTATG(48.8%),其次为IVS16ins3kb(24.4%)、IVS6+5G>A(12.2%)、c.1638_1660dup(12.2%)[12]。本研究对泉州市确诊的20例NICCD患儿进行基因突变分析，发现c.851_854delGTAT/IVS6+5G>A基因型的比例最高，SLC25A13的热点突变为c.851_854delGTAT、IVS6+5G>A、c.1638_1660dup、IVS16ins3kb。例7的基因检测结果为IVS6-11A>G/c.851_854delGTAT复合杂合突变，IVS6-11A>G在HGMD、NCBI、dbSNP、千人基因组计划数据库中均未报道，在100名正常新生儿对照中也未检测到，是一个新突变，2017年本课题组已在论文中提及，并且用HSF软件对IVS6-11A>G进行突变功能预测，发现该突变导致3'端正常剪接位点丢失并激活隐藏的剪接位点导致剪接异常，为可能致病性突变[13]。本研究发现：泉州地区IVS6+5G>A占所有突变的26.3%,仅次于c.851_854delGTAT。2005年，鲁耀邦课题组对4 169名正常中国人的SLC25A13致病基因的研究发现：IVS6+5G>A占所有基因突变的23%,并呈现明显的南北差异[9]。2014年，郭红梅课题组对南京地区21例NICCD患儿的基因突变结果进行分析，发现IVS6+5G>A的比例为16.67%,低于c.851_854delGTAT的64.29%[14]。泉州地区IVS6+5G>A占所有基因突变的比例与上述两个文献报道结果相近。但是，2016年宋元宗课题组对522个SLC25A13等位基因进行研究，发现IVS6+5G>A在北方地区的比例为3.64%,中部地区为8.64%,南方地区为7.91%,南北之间不存在明显差异[15]。宋元宗团队的研究结果中IVS6+5G>A占所有等位基因变异的比例与本文相差较大。因此，后续研究工作将在增加NICCD患儿例数的基础上进一步分析IVS6+5G>A突变的比例。

NICCD基因型与患者生化指标、疾病轻重程度及转归之间的关联尚不清楚，SLC25A13基因突变的表型效应存在不完全外显的现象，同一突变类型临床表现有轻有重。本研究发现：例8、11、12、13、16、18、19、20这8例NICCD患儿的基因型相同，均为c.851_854delGTAT/IVS6+5G>A复合杂合突变。其中，例8及例12出生后3 d的瓜氨酸浓度在正常范围内，而后例8因8个月时出现肝功能异常行SLC25A13基因分析而确诊，例12因5个月时黄疸迁延行SLC25A13基因分析而确诊。例13是例12的哥哥，出生3 d后未参加新生儿串联质谱筛查，后因先证者的家系研究而确诊。例11、16、18、19、20在新生儿串联质谱筛查中瓜氨酸浓度均升高。这8例患儿携带同样的基因型，但有的患儿的瓜氨酸浓度在出生后3 d内即升高，有的迟发升高，这意味着携带相同基因型的NICCD患儿存在临床表型的异质性，可能存在其他影响因素，如某些修饰基因、饮食因素、某种药物的作用等。

SLC25A13基因突变携带率呈现明显的地区差异，以长江为界，江南人群突变基因的携带率高达1/48,泉州市理论上希特林蛋白缺乏症患病率为1/9 200,本研究计算出的NICCD患病率与理论患病率有较大差异，经计算约有70%的NICCD患儿在新生儿筛查中漏筛，与很多NICCD患儿的瓜氨酸浓度迟发升高有关[16-17]。因此，通过串联质谱法筛查NICCD患儿存在漏诊，也间接反映了泉州地区应该有部分希特林蛋白缺乏症患儿存在且处于被忽略的状态。因此，在用串联质谱法分析氨基酸浓度的同时，对出现胆汁淤积、黄疸迁延、肝功能异常的患儿尽早行SLC25A13基因突变分析，有助于NICCD患儿的及时治疗。另外，泉州地区的热点突变为c.851_854delGTAT、IVS6+5G>A、c.1638_1660dup、IVS16ins3kb,占所有等位基因变异的92.1%,可在上述热点突变的基础上建立一种快速筛查、经济的基因分析方法[18]。

参考文献:

[5]顾学范.临床遗传代谢病[M].北京:人民卫生出版社,2015:84-89.

[8]刘文雯,马昕,王美娟,等.16例Citrin蛋白缺陷所致的婴儿肝内胆汁淤积症的SLC25A13基因变异分析[J].中华医学遗传学杂志,2022,39 (2):139-142.

[12]黄新文,张玉,洪芳,等.浙江省新生儿氨基酸代谢疾病筛查及随访分析[J].浙江大学学报,2017,46 (3):233-239.

[13]林壹明,余科,李鹿丰,等.六例瓜氨酸血症患儿ASS1､ASL和SLC25A13基因突变分析[J].中华医学遗传学杂志,2017,34(5):676-679.

[14]郭红梅,郑毕霞,李玫.南京地区21例SLC25A13基因突变致Citrin蛋白缺陷引发新生儿肝内胆汁淤积症的临床分析[J].临床肝胆病杂志,2014,30 (11):1127-1131.

基金资助:福建省泉州市科技计划项目(2019N049S,2021C055R);

文章来源:郑珍珠,林卫华,林壹明,等.泉州地区希特林蛋白缺乏症患儿SLC25A13基因突变谱分析[J].中国妇幼保健,2024,39(18):3606-3610.