摘要:目的探讨依帕列净调节糖尿病相关非编码RNA表达的机制。方法选取6周龄的T2DMSTZ模型小鼠,分成对照组和依帕列净组。依帕列净组小鼠通过饮食给药法,按照每天300mg/kg给予依帕列净治疗,连续给药12w。对照组小鼠给予相同饮食,但不含依帕列净。Western印迹法检测两组钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)2、核转录因子(NF-κB)的蛋白表达。比较两组不同时间体重及血糖。qRT-PCR检测两组SGLT2、Lnc-P12792、MALAT1、KCNQOT1、miR-370mRNA表达。结果各时间点依帕列净组血糖均显著低于对照组(P<0.01)。但两组体重差异无统计学意义。与对照组比较,依帕列净组SGLT2蛋白及mRNA显著降低,Lnc-P12792、MALAT1mRNA显著降低(P<0.05)。两组KCNQOT1mRNA差异无统计学意义。结论依帕列净抑制SGLT2的分子机制可能是通过促进miR-370表达从而介导SGLT2mRNA的降解并抑制其蛋白表达。
2型糖尿病(T2DM)约占所有糖尿病患者的90%,其胰岛素产生能力并未完全丧失但胰岛素受体却有明显减少。T2DM治疗除了胰岛素外主要还包括双胍类、噻唑烷二酮类、磺脲类、α糖苷酶抑制剂等药物,但这些药物均有增加体重同时提高心血管疾病的潜在风险[1,2]。转运蛋白在调节葡萄糖稳态中起重要作用,因为它们是葡萄糖通过细胞膜时的载体与通道。在哺乳动物中,有两类葡萄糖转运蛋白,它们属于溶质载体(SLC)基因序列,包含50多个转运蛋白家族。促进型葡萄糖扩散系统转运蛋白(GLUT1)-4和GLUT6-12由SLC2家族编码,而钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)1~5由SLC5家族编码。
SGLT2负责过滤后的葡萄糖在肾脏中的大量重吸收。SGLT2抑制剂是一类新型T2DM降糖药物,其通过抑制肾脏对血糖重吸收来增加尿糖浓度[3]。依帕列净是这类抑制剂中最有效的一种药物,被广泛用于治疗T2DM[4],其主要作用机制为通过抑制近端小管上的SGLT2蛋白来抑制肾脏对葡萄糖的重吸收,使得尿糖增加、血糖降低达到治疗糖尿病的目的[5,7]。之前的研究都较多集中于对依帕列净临床安全性、药理作用、药动学等方面的研究[8,9],而分子机制尤其非编码RNA方向的研究则鲜有报道。本研究对依帕列净引起组织非编码RNA表达差异进行研究,初步阐述其导致差异表达的相关机制,为其研究提供了新的思路。
1、材料与方法
1.1 材料
TRIZOL(Invitrogen,美国,15596-026),反转录试剂盒(ThermoFisherScientific,美国,K1621)、荧光定量PCR试剂盒(TAKARA,日本,RR014A),SGLT2一抗(abcam,美国,ab85626)、NF-κB一抗(abcam,美国,ab16502)、GAPDH一抗(abcam,美国,ab8245)、山羊抗兔二抗(abcam,美国,ab6721)。
1.2 方法
1.2.1 小鼠给药
选取6周龄的T2DMSTZ模型小鼠6只,分成对照组(3只)和依帕列净组(3只)。依帕列净组小鼠通过饮食给药法,按照每天300mg/kg给与依帕列净治疗,连续给药12w。对照组小鼠给予相同饮食,但不含依帕列净。按时对小鼠血糖和体重进行检测及记录,检测时剪去小鼠尾巴端部约1mm,待有血滴渗出后滴加于血糖检测仪器上,同时记录。
1.2.2 Western印迹检测
Western印迹检测两组SGLT2、NF-κB蛋白表达。将小鼠处死后分别取出肾脏及胰腺,加入800μlRIPA冰浴研磨裂解30min,4℃温度下12000r/min离心30min后去除沉淀。测定浓度后取30μg加入4×上样缓冲液及RIPA配制20μl体积,100℃煮沸5min后冷却上样,进行聚丙酰胺凝胶电泳,80V电泳120min后湿法70V转膜100min。5%脱脂奶粉封闭1h后,一抗孵育过夜,第2天PBST清洗后加入二抗室温孵育1h后滴加显色液曝光。
1.2.3 qRT-PCR
将小鼠处死后分别取出肾脏及胰腺,用1mlTRIZOL研磨裂解后提冰上静置5min,加入200μl三氯甲烷,12000r/min4℃离心15min取上清加入等体积异丙醇,冰浴静置30min后4℃温度下12000r/min离心30min,用75%乙醇洗涤沉淀2次并用无RNA酶的水溶解。测定浓度后取500ng总进行RT-PCR,并用所得cDNA经行Q-PCR并进行分析,内参为β-actin。miR-370的Q-PCR中,直接取用2ng总RNA进行发转,后用miR-370特异探针进行Q-PCR检测,内参为U6。
1.2.4 靶向SGLT2的mRNA序列
通过生物信息学软件预测分析(www.mirbase.org)可能靶向SGLT2(officialsymbol:SLC5A2)的mRNA序列及其结合区域。连续给药12w的小鼠牺牲后,取肾脏提取总RNA。Q-RT-PCR检测靶向SGLT2mRNA的miRNA及糖代谢相关LncRNA的表达量。
1.3 统计学方法
采用SPSS16.0软件进行双尾t检验。
2、结果
2.1 依帕列净可抑制SGLT2表达并降低T2DM模型小鼠血糖水平
与对照组相比较,依帕列净组肾脏中SGLT2的蛋白及mRNA水平明显降低(P<0.05)。依帕列净组血糖含量明显低于对照组(P<0.01)。依帕列净组体重相比于对照组也有降低,但差异无统计学意义。见图1、表1、表2。
2.2 依帕列净可促进靶向SGLT2的miRNA表达增加
miR-370可靶向结合SGLT2基因的3′UTR区域,其序列为UUGGUCCAAGGUGGGGUCGUCCG-5′,共有8mer的配对序列。依帕列净组肾脏中靶向SGLT2mRNA的miR-370的表达量有明显高于对照组(P<0.05)。见图2、表1。
2.3 依帕列净可影响胰腺中糖尿病相关LncRNA的表达
与对照组比较,依帕列净组Lnc-P12792、MALAT1的表达有下降,而KCNQOT1的表达量改变不明显。依帕列净组NF-κB(p65)较对照组显著下降。见图3、表1。
3、讨论
T2DM及其心血管、肾脏并发症的发生率呈上升趋势。因此,除了生活方式的干预外,针对T2DM及其微血管和大血管并发症的预防及治疗,患者还需要使用不同种类的药物。在抗糖尿病药物中,二甲双胍被认为是治疗T2DM的初始药物,但许多患者需要添加第二种药物。SGLT2抑制剂的使用已被证实与许多T2DM患者的代谢和心血管益处相关,其处方率有望大幅增加。
依帕列净是近年来应用于治疗而型糖尿病的新型药物,其对血糖及体重的控制有较明显的作用。为了验证抑制作用的可靠性,本研究结果显示,依帕列净有效抑制SGLT2的转录及蛋白水平,表明本研究给药方法切实可行且与之前试验研究一致[10,11],对小鼠血糖含量检测结果也显示,给药组小鼠的血糖含量降低到正常水平(100mg/dl)。同时对小鼠体重监测结果显示,依帕列净可在降低血糖同时降低体重,这一结果与之前报道一致[12]。
随后对依帕列净抑制SGLT2表达的作用机制进行了研究。通过生物信息学软件进行分析发现,只有miR-370靶向作用与SGLT2的mRNA,其特异性的结合于3′UTR区域,介导SGLT2mRNA的降解抑制其表达。本研究结果提示依帕列净作用机制之一可能通过促进miR-370的表达使得SGLT2的mRNA大量降解,从而抑制SGLT2蛋白的表达量。为了更进一步分析依帕列净对糖尿病相关非编码RNA的影响,本研究对给药小鼠胰腺进行分离并提取了RNA及蛋白。Lnc-P12792、MALAT1两种LncRNA的表达量有降低,而在之前的研究中发现在T2DM的胰岛B细胞中这两种LncRNA的表达量均有升高表达[13,14]。这一结果提示依帕列净在抑制肾脏对血糖重吸收的同时也在分子水平上改善着胰岛β细胞的功能。为了更进一步探究其调控的分子机制,本研究对肾脏组织蛋白样品进行Western印迹检测,实验结果显示其转录因子NF-κB(p65)的表达量有降低趋势。该实验结果证明,依帕列净可能通过抑制转录因子NF-κB(p65)的表达从而降低Lnc-P12792、MALAT1两种LncRNA的表达量。
综上所述,依帕列净抑制SGLT2的分子机制可能是通过促进miR-370的表达从而介导SGLT2mRNA的降解并抑制其蛋白的表达,这一结果降低肾脏对血糖重吸收效率导致尿糖含量增加。同时依帕列净在降低血糖的同时也通过调节LncRNA的表达改善着胰岛细胞的功能,这一结果可能是长期正常血糖含量所引起的,同时也有可能是依帕列净存在其他调节机制,这需要进一步实验进行验证。本研究为依帕列净治疗糖尿病的机制提供了新的依据与分析角度,也为评估其可能存在风险的分析提供新视野,即依帕列净会引起转录因子及非编码RNA的表达改变则会对机体造成其他影响。
参考文献:
[8]杨洁,周亚南,侯美娇,等.小分子钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂的研究进展[J].中南药学,2017,15(6):705-13.
[9]段娟慧,巫冠中.SGLT1/SGLT2双重抑制剂——Sotagliflozin的研究概况[J].中南药学,2015,13(9):947-50.
文章来源:上官同琴.依帕列净调节糖尿病相关非编码RNA表达机制[J].中国老年学杂志,2022,42(05):1183-1185.
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糖尿病是一种代谢和内分泌紊乱性疾病,包括 1型糖尿病、2型糖尿病(T2DM)、妊娠糖尿病和特殊糖尿病[1]。T2DM是最为常见一种慢性代谢性疾病,可导致多种并发症,对心脏、大脑、肾脏等血管系统造成损害,是全球威胁人类健康的重大公共卫生问题[2]。灵芝称为仙草,是药食两用真菌[3]。
2024-04-26糖尿病为临床常见代谢性疾病,其中90%患者属于2型糖尿病,典型症状表现为“三多一少”,对患者日常生活、健康产生不良影响。据2021年数据统计,全世界20~79岁人群中患糖尿病的概率高达10.5%,预计2030年患病率将增长至11.3%。目前尚无彻底根治糖尿病的措施,患者一经确诊,需终身以药物控制血糖水平。
2024-04-222017年的一项统计报告显示,全球大约有4.51亿成年人患有糖尿病,患病率近1/11,其中,以2型糖尿病(T2DM)为主,约占90%。以目前的增长速度预估,至2045年,全球T2DM患者将增至6.93亿,每年死亡人数高达500万人,与T2DM及其并发症有关的医疗支出将增至8 500亿美元。
2024-04-19流行病学研究表明糖尿病(diabetes mellitus, DM)患病率在不同民族之间存在差异,且不同民族糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)患病率及严重程度也并不相同,可能与不同地区、不同饮食方式和遗传学因素等密切相关。回族在甘肃省临夏回族自治州分布广泛,目前关于该地区汉族和回族DR患病率及影响因素的研究较少。
2024-04-152型糖尿病(T2DM)的发病率近年来一直呈上升趋势,对人们的健康和生命安全构成了严重的威胁。T2DM患者在确诊前大多会经历糖尿病前期,包括空腹血糖受损、糖耐量异常及空腹血糖受损合并糖耐量异常,是一种介于正常糖耐量和糖尿病之间的糖代谢异常状态[1]。
2024-04-152型糖尿病视网膜病变(type 2 diabetic retinopathy,T2DR)是2型糖尿病患者最常见的一种并发症,主要发病部位是视网膜微血管,其基底膜变厚,周细胞减少甚至消失,进而影响到内皮细胞正常功能的发挥,出现微血管阻塞现象,也是导致新生血管生成的主要诱因。
2024-04-132型糖尿病视网膜病变(type 2 diabetic retinopathy,T2DR)是2型糖尿病患者最常见的一种并发症,主要发病部位是视网膜微血管,其基底膜变厚,周细胞减少甚至消失,进而影响到内皮细胞正常功能的发挥,出现微血管阻塞现象,也是导致新生血管生成的主要诱因[1]。
2024-04-122型糖尿病是一类因胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗导致血糖水平显著升高的代谢紊乱病,患者临床主要表现为多食、多饮、多尿、乏力、消瘦,随着本病患病人数的不断增加,已成为全球范围内发病率及病死率较高的病种之一[1,2]。研究显示,约30%的患者在使用二甲双胍时会伴有恶心、腹泻、呕吐等胃肠道不良反应,部分患者可因腹泻等药物不良反应而停止使用二甲双胍,对患者血糖控制和生活质量均会产生严重的不良影响[5,6]。
2024-04-11据流行病学资料统计,在全球糖尿病患者中,中国患者数量居世界首位,若未能良好地控制血糖, 极易患并发症, 如糖尿病足、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变以及肛瘘、肛周脓肿等。当机体血糖浓度过高时,身体抗感染能力下降,细菌、病毒侵袭直肠肛管,而致直肠肛管与肛周皮肤相通形成瘘管,此称之为肛瘘,其中只存在一个瘘管的肛瘘为单纯性肛瘘,临床多采取手术治疗。
2024-04-092型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是机体胰岛素分泌不足而引起体内蛋白质、脂肪、糖及水电解质平衡紊乱的一种代谢性疾病,最终可能会影响到心、脑、肾等重要器官以及血管、神经的病变,同时可能还会伴随各种严重并发症[1,2,3]。随着经济的快速发展以及人民生活水平的不断提高,2型糖尿病患者人数也呈现快速增长的趋势,已引起越来越多的关注与重视[4,5]。
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