微小核糖核酸,是一类长度约19～25个核苷酸的内源性非编码RNA,通过与靶信使核糖核酸的特异性结合在转录后或翻译水平对基因表达进行调控。miRNA在内皮细胞损伤时可由细胞质、细胞核游离释放到细胞外。循环中miRNA可能与外泌体或微粒的包裹有关,不易被核糖核酸酶、多次冻融循环和强酸强碱破坏,在循环中较稳定,是潜在的诊断标志物[1]。内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化发病的主要危险因素[2]。早期研究表明miRNAs在血管完整性[3]、血管平滑肌细胞增殖[4]和胆固醇代谢[5]中具有重要作用,某些microRNA还参与调节高脂血症引起的内皮细胞功能障碍[6]。本文就近期miRNA在动脉粥样硬化相关的内皮细胞炎症反应、自噬、凋亡等方面的研究进展作一综述。

1、miRNAs调节内皮细胞炎症

冠状动脉粥样硬化的发展过程中,炎症反应起关键作用。一般认为氧化型低密度脂蛋白刺激内皮细胞分泌大量黏附分子、趋化因子等促炎因子是炎症的开始[7]。

趋化因子介导单核细胞黏附于功能异常的内皮细胞,并促进动脉粥样硬化过程中动脉炎症反应。Akhtar等[8]的研究发现与对照组比较,载脂蛋白E基因缺乏(ApoE-/-)小鼠缺氧诱导因子1α(hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)基因缺失后,动脉病变区域及区域内巨噬细胞聚集和趋化因子CXCL1的表达均减少。体外实验显示ox-LDL可诱导HIF-1α的产生,而HIF-1α又可触发miR-19a介导的CXCL1表达,促进单核细胞黏附和动脉粥样硬化的发生和发展。表明ox-LDL可以通过HIF-1α/miR-19a途径调节CXCL1表达,促进内皮炎症发生,因此,对该途径的抑制可能是抗动脉粥样硬化新的策略。ox-LDL还可以增加内皮连接黏附分子A的功能性表达和再分布,介导炎症细胞进入内皮。miR-145转染内皮细胞时可下调JAM-A的表达,为抑制动脉粥样硬化的发生发展提供了新的靶点[9]。

Ceolotto等[10]对随访11年的患者进行横断面研究和前瞻性验证,发现miR-30c-5p与总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇、颈动脉内膜中膜厚度、粥样硬化斑块发生和发展呈负相关,miR-30c-5p在动脉粥样硬化患者外泌体中含量下降。体内、外实验均证实miR-30c-5p主要通过调节巨噬细胞释放促炎、促凋亡信号减轻对内皮细胞的损害,可抑制动脉粥样硬化早期形成,而miR-30c-5p的下调则加速动脉粥样硬化形成。研究发现miR-499在冠心病患者血浆中表达增加,程序性细胞死亡因子4(programmedcelldeathprotein4,PDCD4)表达减少,两者变化呈负相关[11]。进一步体外实验显示ox-LDL可以诱导内皮细胞上调miR-499表达,上调的miR-499可负向调控PDCD4减少其对NF-κB/TNF-α信号通路的抑制,加重细胞的炎症损伤。miR-103在冠状动脉粥样硬化体内外模型中表达均上调,过表达miR-103通过下调PTEN减轻其对MAPK信号转导通路的抑制从而加重内皮细胞的炎症和内质网应激反应[12]。Wu等[13]证实高迁移率族蛋白B(highmobilitygroupbox1,HMGB1)是miR-328的下游靶标,使用miR-328模拟物转染人脐静脉内皮细胞可显著减少细胞凋亡,提高细胞存活率,并且miR-328过表达能保护内皮细胞避免ox-LDL诱导的炎症和氧化应激过程。而ox-LDL可以通过降低HUVECs中miR-328及其靶蛋白HMGB1的表达促进内皮细胞炎症发生。

miRNA在内皮细胞炎症中也有保护作用。ox-LDL还可抑制内皮细胞miR-20a表达,miR-20a过表达可通过抑制TLR4和NLRP3信号传导保护内皮细胞免受炎症损伤[14]。ox-LDL也可使HCAECs中miR-138表达下调,减轻对PI3K/Akt/eNOS信号通路的抑制加重HCAEC的损伤和炎症反应[15]。凝血酶诱导含miR-25-3p的活化血小板外泌体通过下调α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、甘油三酯、总胆固醇、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,降低A去整合素和金属蛋白酶10的表达,从而抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞炎症和脂质沉积[16]。另有miR-146a和miR-147也被发现参与炎症消除阶段[17]。

2、miRNA对内皮细胞自噬的影响

内皮细胞自噬对动脉粥样硬化发生具有抑制作用,自噬活性受损促进冠状动脉粥样硬化的进展。miRNA主要通过调节自噬基因及其相关通路影响内皮细胞自噬。miR-216a通过靶向调节细胞内Beclin-1水平来控制ox-LDL诱导的HUVECs自噬,可能在心血管疾病和动脉粥样硬化的发病机制中起相关作用[18]。miR-129-5p可能也是通过调控自噬基因Beclin-1参与内皮自噬[19]。研究表明ox-LDL使内皮细胞miR-129-5p显著上调、Bclin-1蛋白产生减少、自噬水平降低,但Beclin-1的mRNA并无变化,因此高脂血症上调miR-129-5p后可能通过抑制Beclin-1的蛋白翻译而削弱内皮细胞自噬的动脉粥样硬化抑制作用。

自噬相关基因(ATG)受多种miRNA调控。Zhang等[20]研究显示miR-30可能通过抑制自噬相关基因ATG6蛋白翻译而抑制内皮细胞自噬。高脂喂养的ApoE-/-小鼠内皮细胞自噬水平下降而miR-30表达增加,后者通过与ATG6mRNA的3′-UTR结合抑制翻译,这些结果与体外ox-LDL处理的血管内皮细胞一致。miR-214-3p则与ATG5和ATG12之间同时具有相关性[21]。体外培养HUVEC并用ox-LDL刺激以启动应激修复自噬进程,结果显示在HUVEC中,miR-214-3p过表达抑制了ox-LDL引发的自噬,促进了HUVEC中的ox-LDL积累和THP-1单核细胞黏附。相反,在衰老的HUVEC中,miR-214-3p保留了对ox-LDL刺激启动保护性自噬反应的能力。在ox-LDL条件下miR-214-3p通过直接靶向作用于ATG5mRNA的3′-UTR调节自噬,miR-214-3p可能在动脉粥样硬化的发病机制中发挥抑制作用。

miR-155与miR-126除调节血管舒张外[22],也对血管内皮细胞的自噬具有调节作用[23]。Yin等[24]发现miR-155的过表达可促进ox-LDL刺激下HUVEC的自噬活性。萤光素酶报告分析显示,miR-155直接与PI3K催化亚基α和Ras同源物直接结合,表明miR-155可能是通过靶向PI3K/Akt/mTOR途径促进血管内皮细胞的自噬。miR-126也是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路恢复ox-LDL诱导的受损自噬流,减轻ox-LDL诱导的HUVECs损伤[25]。

3、miRNA与内皮细胞凋亡

内皮细胞损伤和凋亡在动脉粥样硬化的发展和发病机制中起着关键作用。miRNA通过多种途径参与细胞凋亡。

Zhang等[26]通过建立动脉粥样硬化模型,发现对比对照组,动脉粥样硬化组内皮细胞凋亡水平及miR-429表达升高,Bcl-2蛋白减少,而Bcl-2mRNA无明显变化。荧光素酶鉴定报告证实miR-429可与Bcl-2mRNA的3′-UTR之间的结合。因此,内皮细胞凋亡可能是由于增加miR-429结合并抑制Bcl-2mRNA的翻译使Bcl-2表达下调引起的。miR-365也可通过下调Bcl-2的表达增强ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡[27]。Bcl-XI的下调也使内皮细胞凋亡增加。miR-876可导致抗凋亡蛋白Bcl-XI的翻译受抑,ox-LDL可通过上调miR-876促进内皮细胞凋亡[28]。Zhong等[29]研究显示动脉粥样硬化斑块组织中miR-34a上调,体外ox-LDL也可诱导HUVEC中miR-34a的上调表达,并具有剂量依赖性。Bcl-2是HUVEC中miR-34a的靶标,对miR-34a进行敲减后Bcl-2蛋白的表达和细胞活力提高,改善了线粒体膜电位,并降低了Caspase-3的活性、凋亡细胞的数量以及线粒体中细胞色素c的释放,抑制了HUVEC中ox-LDL诱导的活性氧(reactiveoxygen,ROS)的水平。Su等[30]有同样的结论,认为Bcl-2过表达可显著逆转miR-34a介导的ox-LDL对HAECs生长抑制和促进凋亡的作用。

LOX-1的表达在内皮细胞凋亡过程中同样重要。miR-98可能通过抑制LOX-1而抑制ox-LDL的摄取,维持HUVEC增殖,保护HUVEC免受凋亡[31]。miR-590-5p在mRNA和蛋白水平上均抑制LOX-1的表达,从而降低了ox-LDL诱导的HUVEC凋亡[32],作用机制涉及LOX-1/ROS/p38MAPK/NF-κB信号转导通路和p53-Bcl-2/Bax-Caspase-3信号通路[33]。此外,miR-590可通过阻断TLR4/NF-κB通路促进ox-LDL诱导的内皮细胞增殖以及抑制细胞凋亡[34]。除调节自噬外,miR-26a也可通过靶向调节TLR4mRNA并通过减轻对TLR4/NF-κB信号通路抑制作用从而诱导动脉内皮细胞凋亡[35]。

miR-17能够调节ox-LDL诱导的HUVECs增殖和凋亡[36],miR-497可能通过诱导凋亡和抑制血管内皮细胞增殖[37]促进冠状动脉粥样硬化发展。miR-30c-5p通过靶向调节内皮细胞中的叉头转录因子O3(forkheadboxO3,FOXO3),可能在NLRP3炎性体调节的细胞凋亡中发挥重要作用[38]。动脉粥样硬化模型中miR-122表达升高,对miR-122进行敲减后细胞凋亡减少,实验进一步证明miR-122是通过靶向抑制X连锁凋亡抑制蛋白促进动脉内皮细胞凋亡[39]。miR-410沉默是通过激活信号转导和转录激活因子3减少体外ox-LDL诱导的细胞凋亡,并且抑制ox-LDL诱导的HUVECs增殖[40]。miR-338-3p通过靶向抑制Bambi和激活TGF-β/Smad途径促进ox-LDL诱导的HUVEC细胞损伤[41]。miR-185-5p可与长的非编码RNA-RNCR3以及Kruppel样因子2形成反馈环,以调节内皮细胞增殖、凋亡和平滑肌细胞迁移[42]。抑制miR-221/222表达可增强内皮细胞的凋亡,而miR-221/222的过表达可通过抑制Ets-1及其下游靶点p21来部分缓解由ox-LDL诱导的细胞凋亡死亡[43]。内皮细胞凋亡过程中miR-150表达显著上调,抑制miR-150可部分减轻ox-LDL诱导的凋亡,ox-LDL通过上调miR-150靶向调节ELK1促进内皮细胞凋亡[44]。在ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块中,miR-142-5p的表达水平上调,上调的miR-142-5p可能通控制TGF-β2表达来调节巨噬细胞凋亡[45]。进一步分析表明Rictor是miR-142-3p的直接靶基因,敲减Rictor消除了miR-142-3p抑制剂的抗凋亡作用。此外,研究发现miR-142-3p抑制剂对Akt/eNOS信号通路介导的内皮细胞凋亡具有保护作用。miR-142-3p拮抗剂可减轻ApoE-/-小鼠主动脉中的内皮细胞凋亡并延缓动脉粥样硬化的发展,可能是预防和治疗动脉粥样硬化的潜在靶标[46]。

ox-LDL主要通过调节miRNAs的表达变化改变下游信号通路或靶蛋白的激活或产生,实现对内皮细胞功能的调控。表1总结了ox-LDL调控内皮细胞功能相关的部分miRNAs变化及作用机制。

表1.ox-LDL调控内皮细胞功能相关的部分miRNAs变化及作用机制

4、miRNA参与调整内皮细胞其他功能

miRNA还与内皮通透性、细胞增殖、促血管生成、调节血管稳态等活动相关。

miR-652在不同部位发挥不同作用。Huang等[6]发现miR-652-3p在人和小鼠动脉粥样硬化斑块中上调。miR-652通过抑制细胞周期蛋白CCND2的表达,促进动脉粥样硬化病变的形成。在高脂血症条件下,miR-652-3p在非易感部位内皮细胞中产生抗增殖作用,延缓动脉粥样硬化进展。相比之下,miR-652-3p和CCND2在动脉粥样硬化好发部位和血流紊乱条件下对内皮细胞无明显影响。miR-21-5p和miR-203a-3p在ox-LDL诱导的HUVECs衰老模型中显著上调,Drp1明显下调,同时伴随线粒体功能障碍和AMPK-p53/p16通路的激活,而miR-21-5p或miR-203a-3p抑制剂可减弱这些现象。因此miR-21-5p/203a-3p是通过直接或间接下调Drp1的表达促进ox-LDL诱导的内皮细胞衰老,可以认为血浆miR-21-5p/203a-3p水平可作为评估高脂血症中内皮细胞衰老程度的新生物标志物[47]。

MicroRNA-1是通过下调肌球蛋白轻链激酶激活和表达及ERK/p38MAPK途径来调节ox-LDL诱导的高脂血症,影响内皮细胞通透性等功能[48]。Hu等[49]的研究表明,ox-LDL可通过诱导miR-496表达来抑制Hippo-YAP/ZAP通路蛋白的表达,导致YAP蛋白无法进入细胞核,从而丧失了其作为激活下游基因的转录辅因子的功能,致使血管内皮细胞功能障碍。王宁宁等[50]通过建立血管内皮损伤模型发现miR-181低表达,Importin-α3及其下游NF-κB信号转导通路与ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤有关,因此miR-181表达上调可能通过Importin-α3/NF-κB途径减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤。抑制miR-183的表达也可以上调其靶基因胰岛素受体底物1的表达,抵抗ox-LDL对内皮细胞的损伤[51]。使用ox-LDL刺激人脐静脉内皮细胞可上调长链非编码X染色体失活基因表达,X染色体失活基因又通过下游miR-320/NOD2(核苷酸结合寡聚化结构域2)调控网络产生内皮损伤,因此miR-320是高脂血症损伤内皮的因素之一。下调X染色体失活基因表达可通过miR-320/NOD2调控网络对ox-LDL诱导的HUVEC损伤产生保护作用[52]。

miR-92a在低剪切应力和致动脉粥样硬化ox-LDL的条件下表达上调。低剪切应力条件下,miR-92a调节ox-LDL对内皮细胞的激活,可能与Kruppel样因子2、Kruppel样因子4等相关[53]。在小鼠体内特异性阻断miR-92a的表达可减少内皮炎症并抑制动脉粥样硬化的发展。Liu等[54]对180例冠心病患者进行前瞻性研究。结果显示,冠心病患者miR-92a-3p显著增加。微泡分选实验表明,内皮细胞是含miR-92a-3p微泡的主要来源。体外ox-LDL和IL-6刺激可增加细胞中miR-92a-3p的表达,并上调内皮微泡结合的miR-92a-3p表达,miR-92a-3p被转运到受体内皮细胞,加速细胞的迁移和增殖,对miR-92a-3p的敲减阻断了血管网络的形成。血小板反应蛋白(thrombospondin1,THBS1)是miR-92a-3p的靶标和血管生成的抑制剂。内皮微泡介导的功能性miR-92a-3p通过THBS1依赖机制调节受体内皮细胞的血管生成作用。miR-92a拮抗剂似乎是一种抗动脉粥样硬化治疗的新策略[53]。ox-LDL可通过调节miR-758损伤血管内皮细胞。miR-758的过表达可以通过在G0/G1期阻滞细胞周期抑制HUVEC增殖,使毛细血管形成能力明显降低[55]。miR-9则通过负反馈调节氧化型低密度脂蛋白受体1介导的p38/MAPK通路,在ACS小鼠易损动脉粥样硬化斑块的形成中起抑制作用,并促进血管重构[56]。miR-590-5p对LOX-1和氧化还原敏感信号传导的调控还能抑制血管生成[57]。最新研究表明,miR-144-5p可通过靶向作用信号转导蛋白SMAD1调节HUVEC的功能,上调miR-144-5p除能抑制HUVEC的增殖及诱导凋亡外,还能抑制内皮细胞迁移和侵袭[58]。

先前的研究表明miR-125a-5p在高脂血症-高血糖状态下增加并参与细胞凋亡,Zeng等[59]认为miR-125a-5p可能参与ox-LDL诱导的血管内皮细胞焦亡。其研究发现miR-125a-5p可以在转录后水平抑制甲基胞嘧啶双加氧酶2(tetmethylcytosinedioxygenase2,TET2)的表达,导致DNA异常甲基化、线粒体功能障碍、增加活性氧的产生、激活NF-κB通路,从而诱导炎症小体的激活和成熟、释放促炎细胞因子IL-1β和IL-18以及细胞炎症坏死,促进动脉粥样硬化发生。miR-125a/b-5p还通过直接靶向前体内皮素-1(preproET-1)mRNA的3′-UTR,抑制ox-LDL诱导的ET-1表达。miR-125a/b-5p抑制剂可以直接增强preproET-1表达。表明ox-LDL通过下调内皮miR-125a/b-5p表达减轻对血管内皮细胞ET-1表达的抑制作用,破坏血管稳态[60]。

5、总结与展望

综上所述,miRNA参与内皮细胞损伤过程,虽然针对高脂血症条件下内皮损伤中miRNA的研究已有很大进展,但作为新型标记物仍存在问题。作为生物标记物,需要具有良好的特异性及灵敏性,参与冠状动脉粥样硬化的miRNA种类多,哪一些具有较高特异性暂不十分明确,且是否完全可以释放到循环中和在被检测之前是否已经进入其他细胞中发挥作用仍不清楚,需要进一步研究阐明。

参考文献：

[1]裴颖皓,宫剑滨.miRNA在急性心肌梗死诊断中的研究进展[J].医学综述,2014,20(4):616-618.

[22]杨惠林,徐士欣,张军平,等.外泌体中的微小RNA在动脉粥样硬化中的作用[J].中国动脉硬化杂志,2019,27(1):75-80.

[32]秦冰,肖波,姜婷,等.miR-590-5p对ox-LDL诱导血管内皮细胞凋亡以及LOX-1表达的影响[J].中南大学学报(医学版),2012,37(7):675-681.

[50]王宁宁,孙晓,张晓璐,等.微小RNA-181减轻氧化低密度脂蛋白诱导的血管内皮细胞损伤的作用及机制[J].中华心血管病杂志,2017,45(3):230-234.

杨秀红,王玉强,杜正任,魏延津.高脂血症冠状动脉内皮损伤相关的微小RNA研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2020,28(08):721-727.