新型冠状病毒感染(coronavirus disease 2019, COVID -19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染引发的新发急性呼吸道传染病，在世界范围内大流行，给人民生活和经济发展带来了重大影响[1]。

COVID -19患者除了典型肺炎等呼吸系统症状外，还可累及多组织、多器官，但合并其他呼吸道病原体感染或继发感染对COVID -19的影响尚不清楚。初诊时，COVID -19患者与其他病原体共感染率为3.5%,病程中或住院期间继发其他呼吸道病原体感染的比率为15.5%[2]。在武汉COVID -19暴发早期，94.2%(242/257)患者有病毒性、细菌性和真菌性继发感染，其中COVID -19重症患者继发感染率最高[3]。COVID -19共感染病原体主要包括肺炎克雷伯菌、肺炎支原体、曲霉、流行性感冒病毒及冠状病毒等，潜在病原体共感染可能会增加SARS-CoV-2诱导炎症因子风暴的风险[4]。

肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae, Cpn)是一种严格细胞内寄生菌，可引起非典型肺炎及社区获得性肺炎等。由于大部分Cpn感染患者临床症状不明显，临床Cpn感染通常被漏诊[5]。Cpn与SARS-CoV-2同为呼吸道疾病病原体，通过呼吸道飞沫传播，主要诱导机体Th1免疫反应，并具有多种共同的风险因素[6-7],然而，Cpn与SARS-CoV-2共感染的特征及其对SARS-CoV-2诱导炎症反应的影响尚不清楚。因此，本研究通过对COVID -19患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)及血清中细胞因子进行检测，同时检测血清中Cpn IgG/IgM水平，分析Cpn与SARS-CoV-2共感染特征及其对SARS-CoV-2诱导机体炎症反应的影响，以期为COVID -19患者的治疗提供新思路。

1、对象与方法

1.1研究对象

选取2022年12月20日—2023年2月20日于郴州市某医院就诊的COVID -19病例作为研究对象，以Cpn IgM阳性合并SARS-CoV-2核酸阳性确定为两者共感染。按COVID -19患者疾病严重程度将其重型和危重型作为重症组，轻型和中型作为轻症组，再依据患者年龄(≥18岁为成年，<18岁为未成年)分为成年重症组、成年轻症组，未成年重症组、未成年轻症组。采用倾向性评分对各组患者的年龄、性别、基础疾病进行1∶1匹配，容差设置为0.5。本研究经该院伦理委员会批准(批准号：2023015)。

1.2纳入与排除标准

纳入标准：①参照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第九版)》,确诊为COVID -19,SARS-CoV-2核酸检测为阳性；②具有支气管镜检查适应证并进行支气管镜检查；③自愿在知情同意书上签字(未成年人及重症患者由监护人代签);④临床资料完整。排除标准：①备孕期育龄女性、哺乳期妇女或妊娠期妇女；②中途主动退出治疗。

1.3试验方法

1.3.1细胞因子检测

采用多重微球流式免疫荧光发光法检测白细胞介素(IL)-5、干扰素(IFN)-α、IL-2、IL-6、IL-1β、IL-10、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-12、IL-4、IL-17、IFN-γ及IL-8水平。根据试剂盒(瑞斯凯尔)说明进行操作，首先加入25μL校准品、血清或BALF标本，再加入25μL捕获微球抗体，充分混合均匀后，加入检测抗体及藻红蛋白标记的链霉亲和素室温避光孵育，250 g离心5 min后去上清，再加入250μL洗涤缓冲液重悬，应用流式细胞仪BriCyt E6检测荧光发光强度，再根据标准曲线计算标本中的细胞因子含量与浓度。

1.3.2 Cpn IgG/IgM检测

采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清Cpn IgG/IgM水平。根据试剂盒(珠海丽珠生物技术有限公司)说明进行操作，设空白对照、临界值及阳性对照，分别加入酶结合物、底物孵育后，显色15 min,加入终止液后，酶标仪测定标本OD450值，再按照阳性、阴性判定值判别结果。

1.4统计学方法

应用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差或中位数(四分位间距)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料比较采用卡方检验；病例对照研究的危险因素分析采用logistic回归分析。以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1基本特征

共收集COVID -19患者107例，其中5例患者因未收集到血清标本而未纳入本研究。共采集102例患者进展期的BALF和血清标本，以及39例恢复期血清标本开展Cpn抗体和细胞因子检测，最终纳入102例患者。其中重型和危重型(重症)患者61例，轻型和中型(轻症)患者41例；年龄≥18岁患者71例，年龄<18岁未成年患者31例。成年重症组患者39例，成年轻症组患者32例，经倾向性评分成功匹配30对；未成年重症组患者22例，未成年轻症组患者9例，经倾向性评分成功匹配8对。见表1。

2.2 Cpn感染与COVID-19严重程度的分层分析

COVID -19患者中Cpn IgG、IgM阳性率分别为36.27%(37例)、8.82%(9例),其中1例Cpn IgG和IgM同为阳性，纳入IgM阳性组。Cpn IgG阳性患者中，COVID -19重症患者占46.67%(14/30);Cpn IgG阴性患者中，COVID -19重症患者占52.17%(24/46),两组比较差异无统计学意义(P>0.05);Cpn IgM阳性患者与Cpn IgM阴性患者COVID -19重症占比比较，差异无统计学意义(16.67% VS 52.86%,P>0.05)。Logistic回归分析结果显示，Cpn IgG阳性和IgM阳性均不是导致COVID -19发展成重症的危险因素[OR=1.27,95%CI(0.51～3.17),P=0.612;OR=0.19,95%CI(0.02～1.67),P=0.136]。进一步分层分析发现，成年患者中Cpn IgG阳性组与阴性组、IgM阳性组与阴性组以及未成年患者中Cpn IgG阳性组和阴性组、IgM阳性组和阴性组COVID -19重症占比比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表1COVID -19轻症组与重症组患者基本特征比较

表2Cpn IgG/IgM与COVID -19严重程度分层分析(例)

2.3 Cpn与SARS-CoV-2共感染患者细胞炎症因子分泌情况

成年重症组Cpn IgG阳性患者血清标本IFN-α为(2.35±4.41)pg/mL,高于Cpn IgG阴性患者的(1.71±0.69)pg/mL,差异有统计学意义(P<0.05)。成年轻症组Cpn IgG阳性患者血清标本IL-8、IL-17水平均低于Cpn IgG阴性患者[分别为(12.68±34.87)pg/mL VS(25.42±234.52)pg/mL;(5.58±5.69)pg/mL VS(9.39±15.82)pg/mL,均P<0.05],血清及BALF标本中其他细胞因子水平Cpn IgG阳性组与阴性组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。成人重症组、轻症组患者中，Cpn IgM阳性或阴性者血清及BALF标本中细胞因子水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图1。

未成年重症组、轻症组患者中，Cpn IgG阳性或阴性患者血清及BALF标本中细胞因子水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05),未成年轻症组Cpn IgM阳性患者血清及BALF标本中IL-8水平高于Cpn IgM阴性患者[分别为(2 006.87±451.62)pg/mL VS(130.06±229.66)pg/mL;(1 284.78±801.79)pg/mL VS (228.39±238.83)pg/mL,均P<0.01]。未成年重症组无Cpn IgM阳性病例，故未做比较分析。见图1。

图1Cpn与SARS-CoV-2共感染患者急性期细胞因子分泌情况

2.4 Cpn感染对COVID-19患者恢复期细胞因子分泌的影响

COVID -19患者经治疗恢复达到出院标准时，收集其血清标本检测细胞因子水平，结果显示除Cpn IgG阳性成人轻症组患者IFN-γ水平高于Cpn IgG阴性患者外[(2.92±0.84)pg/mLVS(2.19±0.42) pg/mL,P<0.05],各组血清标本其他细胞因子水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见图2。

图2Cpn与SARS-CoV-2共感染患者恢复期血清标本细胞因子水平

3、讨论

自2019年COVID -19大流行以来，SARS-CoV-2与其他病原体共感染相关研究备受临床关注，但SARS-CoV-2与Cpn共感染的研究甚少。目前，关于COVID -19患者共感染的界定还存在争议，有学者认为共感染特指患者感染2种或2种以上不同病原体而急性发病的现象，但临床上患者初诊或入院时大多不可能同时进行多重病原体的实验室检测[8-9];研究[10-11]分别将SARS-CoV-2感染确诊2、3 d以内的其他病原体感染定义为共感染；Hughes等[12]则以SARS-CoV-2检测后5 d以内细菌或真菌检测阳性判定为共感染。按发病时序来看，COVID -19患者发生的共感染常为社区感染[8],考虑到Cpn是引起社区获得性肺炎的重要病原体，因此，本研究同时检测了COVID -19患者急性期Cpn IgG和IgM抗体(IgG阳性提示既往感染，IgM阳性提示新近感染),以Cpn IgM阳性合并SARS-CoV-2核酸阳性确定为两者共感染。Cpn DNA较Cpn抗体具有更高的灵敏度，并提示患者新近感染，但考虑到生物安全等因素，本研究未检测Cpn DNA。本研究通过检测102例COVID -19患者进展期血清标本中Cpn抗体，发现Cpn IgG和IgM阳性率分别为36.27%、8.82%,高于印度及俄罗斯COVID -19患者Cpn IgM阳性率(分别为3.61%、5.29%)[2, 13]。此外，本研究检出1例患者Cpn IgG和IgM同为阳性，提示患者Cpn既往感染并再次新近感染Cpn,或新近感染Cpn,另考虑到患者出现Cpn感染呼吸道症状，因此将其归属于Cpn IgM阳性组。

COVID -19未成年患者症状通常较成年患者轻。儿童呼吸道黏膜中的免疫细胞不仅数量更多，还能更快地分泌Ⅰ型IFN,这在早期抵御SARS-CoV-2发挥了重要作用[14]。为进一步明确Cpn对未成年和成年COVID -19患者严重程度的影响是否存在差异，本研究对未成年和成年患者进行分层分析发现，成年和未成年患者中，Cpn IgG阳性组与IgG阴性组、IgM阳性组与IgM阴性组COVID -19重症占比比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。

肺组织是SARS-CoV-2感染和损伤的主要靶器官，Cpn也是肺组织嗜性病原体。本研究发现Cpn IgG和IgM都不是导致COVID -19进展成重症的危险因素，提示Cpn既往或新近感染可能与COVID -19的严重程度无直接关联。然而，De等[15]报道SARS-CoV-2合并Cpn感染患者中重症所占比率高于单独SARS-CoV-2感染者，SARS-CoV-2合并Cpn感染患者鼻插管、高流量氧支持和无创机械通气等呼吸支持手段临床应用率也高于单独SARS-CoV-2感染患者，提示Cpn与SARS-CoV-2共感染对COVID -19严重程度的影响可能存在地区或人群差异，具体原因尚需进一步研究。

BALF标本中含有肺内下呼吸道细胞和溶质，能更全面反映肺部整体情况，BALF标本的细胞因子指标对肺损伤诊断具有重要临床意义。因此，为进一步了解Cpn对SARS-CoV-2诱导肺部及全身炎症反应的影响，本研究检测了Cpn与SARS-CoV-2共感染患者BALF及血清标本中12种常见细胞因子水平，发现成人COVID -19重症合并Cpn IgG阳性患者血清IFN-α水平高于其阴性患者，而轻症Cpn IgG阳性患者血清IL-8、IL-17水平均低于其阴性患者，其他细胞因子水平比较差异均无统计学意义，提示Cpn感染对COVID -19患者肺局部及全身炎症反应影响不大。值得注意的是，本研究发现未成年COVID -19轻症合并Cpn IgM阳性患者血清及BALF标本中IL-8水平均高于Cpn IgM阴性患者，可能是未成年患者新近感染Cpn后，能诱导肺部及循环系统免疫细胞快速分泌IL-8,募集和激活中性粒细胞，达到早期抵抗Cpn与SARS-CoV-2损伤机体的目的，影响继续发展为重症[16]。

本研究存在以下局限性。首先，本研究尽管收集了102例COVID -19患者血清和BALF标本，病例纳入数量较类似研究多[17],但在进行成年与未成年、Cpn IgG和IgM阳性与阴性等分层研究时，发现每组样本量不足，可能影响结果的可靠性。其次，由于本研究旨在了解Cpn对SARS-CoV-2诱导炎症反应的影响，因此未分析COVID -19重症与轻症患者炎症反应的差异。另外，本研究是一项单中心回顾性研究，虽然进行了严谨的设计，但不可避免存在混杂因素干扰，对研究结果造成偏倚。因此，后续研究还有待进一步扩大临床样本量，深入阐明Cpn感染对COVID -19患者肺部及全身炎症反应的影响。

综上所述，本研究结果提示Cpn不是导致COVID -19进展成重症的危险因素；Cpn感染对SARS-CoV-2导致的炎症因子分泌影响有限。本研究结果可为COVID -19患者的诊疗提供新的依据，同时对其他类似非典型病原体相关研究也有启示作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。

参考文献:

[7]申秀丽,郝彦玲,王书晖,等.新冠灭活疫苗序贯免疫对Wuhan-Hu1和Omicron变异株的体液免疫反应[J].中华实验和临床病毒学杂志,2023,37(2):121-127.

[8]何礼贤.关于新型冠状病毒肺炎的深度思考:共感染[J].微生物与感染,2021,16(6):373-377.

基金资助:湖南省自然科学基金项目(2024JJ7032);湖南省卫生健康高层次人才重大科研专项(R2023065);白求恩公益基金项目(20221206-03);

文章来源:李佳艳,袁丽萍,罗庆凯,等.肺炎衣原体与新型冠状病毒共感染及其对机体炎症因子分泌水平的影响[J].中国感染控制杂志,2024,23(11):1391-1397.