新型冠状病毒肺炎（COVID-19），由于其具有较高的传染性和人群易感性，目前全球多个国家发生COVID-19疫情，引起了世界卫生组织的极度关注[1]。COVID-19是21世纪发生的第3起冠状病毒感染事件。冠状病毒主要通过表面的S蛋白识别靶细胞上的相应受体进入细胞，引发感染[2]。新型冠状病毒（SARS-Co V-2）是目前发现的第7种可感染人类的冠状病毒[3]，它与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-Co V）同源性达79.5%[4]。研究已证实SARS-Co V-2与SARS-Co V均可与血管紧张素转化酶II(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）结合进入细胞[5],ACE2是SARS-Co V-2感染细胞的必需蛋白[6]。

SARS-Co V-2进入宿主细胞后，释放RNA与细胞中核糖体结合，翻译出病毒复制所需的3C类似蛋白酶（protease 3C-like,3CLpro）等蛋白酶，并依赖病毒自身的RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）进行RNA复制过程[7]。因此3CLpro与Rd Rp在SARS-Co V-2的致病过程中同样起到关键作用。目前尚未发现治疗COVID-19的特效药物，但临床用药结果显示中西医结合疗法具有较好疗效[8]，《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》亦收载有中医特色治疗方案。

根据中医理论，COVID-19为疫疠之邪致病，属于中医“温病-疫病”范畴。中医典籍对疫病记载甚多。如《素问·刺法论》：“五疫之至，皆相染易，无问大小，病状相似”。《温疫论》：“温疫之为病，非风非寒，非暑非湿，乃天地间别有一种异气所感”。COVID-19患者外感疫疠之气，“湿、热、毒、瘀”之邪侵犯机体，湿困脾闭肺，气机升降失司，湿毒化热，而瘀热内闭，热深厥亦深。本病早期以“湿热伤肺”为主要病因病机，轻症可以以中成药治之[9]。清开灵注射液作为我国中医院急诊科（室）必备中成药之一，具有抗病毒、抗炎、解热、免疫调节等多种药理作用，广泛应用于急性肺炎、上呼吸道感染，高热等疾病的临床治疗。本方由安宫牛黄丸拆方改制而成，安宫牛黄丸出自清代温病大家吴瑭所著《温病条辩》，应湿热之邪内陷心包之证而设，有清热解毒、豁痰开窍之功。清开灵注射液在保留原方治病精髓的同时又加以改制，以牛黄、猪胆二者提取物（胆酸、猪去氧胆酸）为治病之要，牛黄、猪胆味苦性凉，共奏清热解毒、镇咳平喘、豁痰开窍之效；金银花清热解毒、疏散风热，水牛角清热泻火、凉血解毒，黄芩（黄芩苷）清热燥湿、泻火解毒，三者为臣，清热燥湿解毒，泻肺之实火，并助君药清泻心包热毒；栀子、板蓝根为佐药，苦寒清降利湿，善清热解毒、凉血利咽；珍珠母镇惊安神[10]。综观全方，清热解毒，镇咳平喘，燥湿豁痰，湿邪得去，则诸症自除。清开灵注射液目前已被辽宁、河北、陕西、上海等省市的“新型冠状病毒肺炎防治方案”以及湖北武汉同济医院制定的最新版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案及预防方案》列为推荐用药，对于治疗COVID-19具有极大的应用价值。但是清开灵注射液治疗COVID-19的具体作用机制目前尚不明晰。本研究运用网络药理学构建清开灵注射液的药物-化合物-靶点网络，并进行代谢通路分析以及分子对接验证，初步探寻清开灵注射液治疗COVID-19的作用机制，以期为今后的临床应用以及新药研发提供依据。

1、材料与方法

1.1清开灵注射液中化学成分的收集

文献检索“珍珠母”“水牛角”的化学成分以及“猪去氧胆酸”的化学结构式，利用Molinspiration Cheminformatics(https://www.molinspiration.com/）数据库，获得猪去氧胆酸的分子信息；借助TCMSP(http://tcmspw.com/），检索“胆酸”“黄芩苷”的分子信息，并以“栀子”“金银花”“板蓝根”为关键词检索3者的化学信息。将简化的Lipinski五规则，即相对分子质量（Mw）≤500、脂水分配系数（miLogP）≤5、氢键给体数目（nOHNH）≤5、氢键受体数目（nOH）≤10以及类药性（DL）≥0.18作为活性化学成分的筛选依据，同时得到各活性成分相关靶标蛋白。

1.2药材-化合物-靶点网络及蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建

将猪去氧胆酸的SMILES格式导入Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库，得到对应基因靶点。将“1.1”项得到的靶标蛋白导入Uniprot(https://www.uniprot.org/）数据库，选择物种为“Human”，得到蛋白对应基因。将所得基因靶点与COVID-19疾病相关靶点（通过文献检索得到结肠上皮细胞中与ACE2共表达的基因）进行交集分析，并用Cytoscape 3.7.2(http://www.cytoscape.org/）软件构建药物-化合物-靶点网络。

1.3靶点的通路分析

借助Uniprot(https://www.uniprot.org/）数据库查询靶点基因对应ID，导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/）数据库，进行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，将结果导入Omic Share Tools(http://www.omicshare.com/tools/index.php/）绘制高级气泡图使结果可视化。

1.4分子对接验证

选择ACE2、Rd Rp、3CLpro作为抗COVID-19药物潜在作用靶点，与核心活性成分及临床推荐用药（洛匹那韦、利托那韦、利巴韦林）进行分子对接。

借助RCSB PDB(https://www.rcsb.org/）数据库下载靶点的3D结构的pdb格式文件。借助ZINC(http://zinc.docking.org/）数据库下载化合物3D结构的mol2格式文件。在软件MAESTRO version 11.5中导入靶点的3D结构，经过去水、加氢、能量最小化等系列操作，运用Glide模块Ligand Docking面板进行分子对接，对接方式选择柔性对接，以对接评分Docking Score为依据评价化合物与受体的匹配情况。

2、 结果

2.1活性化合物的筛选

保留胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷以及栀子、板蓝根、金银花中质量控制指标成分（栀子苷、R,S-告依春、绿原酸、木犀草苷）作为活性化合物。对栀子、板蓝根、金银花、珍珠母、水牛角中其他化学成分进行筛选，以简化的Lipinski五规则（Mw≤500、mi Log P≤5、n OHNH≤5、n OH≤10）、DL≥0.18为指标，筛选出活性化合物67个，其中9个来自栀子、36个来自板蓝根、26个来自金银花，栀子与金银花共有成分3个，板蓝根与金银花共有成分1个。珍珠母、水牛角中蛋白质、氨基酸等成分因不符合指标要求被剔除。清开灵注射液中部分活性化合物的基本信息见表1。

表1清开灵注射液中部分活性化合物的基本信息

Table 1 Basic information of some active compounds in Qingkailing Injection    下载原表

表1清开灵注射液中部分活性化合物的基本信息

2.2药物-化合物-靶点网络的建立

在TCMSP数据库中检索各活性成分对应靶标蛋白，导入Uniprot数据库进行基因名称矫正。因TCMSP中未收录猪去氧胆酸，将猪去氧胆酸的SMILES格式导入Swiss Target Prediction数据库，选择物种为“Homo sapiens”，筛选出possibility>0.7的靶点基因[10]。共得到活性成分对应的靶点基因247个。

现代药理研究表明，SARS-CoV-2与ACE2结合是病毒感染细胞的关键环节。Wang等[11]应用单细胞测序识别技术得到结肠上皮细胞中与ACE2共表达的5 556个基因，将这5 566个基因与247个靶点基因进行交集分析，得到70个靶标与ACE2共表达。提示清开灵注射液中活性成分可能通过作用于这70个靶标，影响SARS-CoV-2与ACE2结合，发挥对COVID-19的治疗作用。筛选出上述70个靶点所对应的化学成分，共筛选得到62个化学成分。

构建的药物-化合物-靶点网络包括5个药物节点，62个化合物节点，70个靶点节点以及322条边。结果见图1。每个靶点平均与4.6个化合物相互作用，每个化合物平均与5.2个靶点相互作用，说明清开灵注射液可通过多成分、多靶点的协同作用发挥疗效。

2.3 PPI网络构建

将上述70个药物作用靶点导入STRING 11.0数据库，绘制PPI网络图，结果见图2。节点代表靶标蛋白，边代表蛋白之间的相互作用关系，线条多少代表蛋白之间相互关联的强度大小。其中度（degree）值≥2倍中位数的靶点有12个，见表2。提示这12个靶蛋白可能是PPI网络中的核心靶点，清开灵注射液很可能是通过作用于这些靶点发挥对COVID-19的治疗作用[12]。

2.4靶点KEGG通路富集分析

对“2.3”项中筛选得到的70个靶点基因进行KEGG通路富集分析，筛选得到41条信号通路（P<0.05），主要涉及细胞凋亡、Fc epsilon RI信号通路、TNF信号通路等，见图3。

2.5清开灵注射液中活性成分与抗COVID-19药物潜在作用靶点的分子对接验证结果

在“2.2”项下得到的62个化学成分中，选择其中度值≥2倍中位数的化学成分以及《中国药典》2015年版规定的清开灵注射液含量测定指标（胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷）作为核心成分[13]。将得到的17个核心成分与抗COVID-19药物潜在作用靶点ACE2(PDB ID:1R42）、RdRp(PDB ID:6NUR）、3CLpro(PDB ID:6LU7）进行分子对接验证[3]。RdRp抑制剂利巴韦林，3CLpro抑制剂洛匹那韦、利托那韦已被《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》收录，并广泛应用于临床治疗[7]。因此选择利巴韦林、洛匹那韦、利托那韦分别与对应靶点对接，作为对照，结果见表3。

图1清开灵注射液药物-化合物-靶点网络

猪去氧胆酸无分子ID，图中以“HDCA”代表猪去氧胆酸分子

Hyodeoxycholic acid has no molecular ID.In the figure,"HDCA"represents hyodeoxycholic acid

图2清开灵注射液作用于ACE2的靶蛋白PPI网络

表2清开灵注射液核心靶点信息

一般认为进行分子对接时对接评分的绝对值越大，化合物与靶点亲和力越强，构象越稳定。绝对值大于4.25表示具有一定的结合活性，大于5.0表示具有较好的结合活性，大于7.0表示具有强烈的结合活性[14]。分子对接结果显示，刺槐素、丁香苷与ACE2的结合能力强于洛匹那韦；除胆酸、猪去氧胆酸、栀子苷外其余核心成分与Rd Rp的结合能均高于利巴韦林；甜橙黄酮与3CLpro的亲和力较洛匹那韦更强。综合分析，刺槐素、丁香苷、甜橙黄酮可能是清开灵注射液治疗COVID-19的关键成分。

图3清开灵注射液靶标的KEGG通路富集分析

表3清开灵注射液活性成分、推荐药物与抗COVID-19药物潜在作用靶点的分子对接结果

3个靶点中刺槐素与ACE2的对接评分绝对值最大；靶点ACE2、RdRp、3CLpro分别与丁香苷、5-羟基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧苯基)色酮、甜橙黄酮的亲和力最强。分子对接3D模式及2D模式见图4。

图4分子对接模式图

3、 讨论

COVID-19属于中医疫病范畴，具有起病急、变化快、病情凶险的特点，极大危害人民生命健康，严重影响社会秩序。中医药因其辨证论治、整体合参、未病先防，既病防变等特点，在COVID-19临床各阶段治疗中发挥了独特优势，取得了良好的效果。结合临床症状、地域特点等进行综合考量，本次“疫病”当属“湿疫”，全国各地中医诊疗方案以清热解毒祛湿为主。清开灵注射液长于清热解毒燥湿，其抗病毒、调节免疫的功效也符合中医对疫病“扶正驱邪”的治疗原则[15,16]。清开灵注射液临床以静脉注射途径给药，可直达病位，迅速起效，宜在疫毒闭肺阶段应用。疫毒闭肺系湿毒郁肺，入里化热所致，重症COVID-19患者可见疫毒闭肺、弥漫三焦、气血两燔，危重患者可发展为疫毒闭肺、正气虚脱之证[17]，因此清开灵注射液主要适用于重型、危重型COVID-19的治疗。

3.1核心成分的治疗作用分析

本研究运用网络药理学构建清开灵注射液的药物-化合物-靶点网络，得到活性成分62个以及对应靶点70个。筛选出其中17个活性成分作为清开灵注射液治疗COVID-19核心成分，其中多数属于黄酮类化合物。现代药理研究结果表明，黄酮类化合物具有抗炎、抗病毒、免疫调节等作用。它可以通过影响花生四烯酸代谢酶及其代谢产物，抑制炎性介质释放，发挥抗速发型过敏反应的作用[18,19]，推测其对SARS-CoV-2感染产生的细胞因子风暴（病毒感染机体后，炎症因子大量分泌引发细胞因子级联反应，免疫系统受到干扰造成的机体过度免疫现象）可能具有抑制效果[20]。有研究表明，荔枝核中的黄酮类成分对SARA-CoV 3CLpro蛋白具有很强的抑制作用，已知SARS-nCoV和SARS-CoV-2的3CLpro蛋白的氨基酸序列具有96%同源性，提示黄酮类成分可能具有一定的抗SARS-CoV-2作用[7,21]。此外，黄酮类化合物是天然高效的免疫调节剂，可以增强NK细胞和T细胞的杀伤能力，提高抗体效价和免疫器官指数，应用于COVID-19治疗时与中医“扶正祛邪”的思路相吻合[22]。

分子对接结果显示，上述17个核心成分中刺槐素、丁香苷、甜橙黄酮可能是清开灵注射液治疗COVID-19的关键成分。刺槐素属于黄酮类成分，具有明显的抗炎镇痛、抗流感病毒活性[23,24]，也是潜在的脓毒症保护剂。SARS-CoV-2感染机体后，部分重症患者可在短期内迅速发展为脓毒症休克，脓毒症诱导肺损伤，使病情进一步加重。刺槐素可以通过发挥抗炎、抗氧化作用，显著减轻脓毒症及其所致肺损伤[25]，对COVID-19病程进展起到一定的干预作用。丁香苷可以通过抑制炎性因子前列腺素和NO的合成与释放，减轻急性炎症早期的毛细血管扩张及渗出水肿，以及抑制炎症中后期纤维组织增生和肉芽形成，提示其对SARS-CoV-2所致细胞因子风暴可能具有一定的缓解作用。此外，丁香苷还可以增强非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫功能，增强机体抵抗疾病的能力[26]。甜橙黄酮可以抑制诱导性一氧化氮合酶（iNOS）、环氧化酶-2(COX-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子及炎症介质的产生与表达，从而发挥抗炎、改善细胞因子风暴的作用[27]。

胆酸、猪去氧胆酸在清开灵注射液方中发挥君药作用，具有清热解毒、镇咳祛痰以及显著的抗炎功效[28]，在清开灵注射液治疗COVID-19的过程中同样发挥关键作用。然而分子对接验证结果显示，二者与ACE2、RdRp、3CLpro的亲和力较弱。已知胆酸、猪去氧胆酸属于甾体类化合物，对应靶标较多[29]。二者进入血液后，部分与血浆蛋白结合成为结合型药物，未参与结合的游离型药物可直接作用于疾病相关靶位发挥药效[30]。推测胆酸、猪去氧胆酸与血浆蛋白等其他靶点的亲和力可能较ACE2、RdRp、3CLpro更强，ACE2、RdRp、3CLpro并非二者治疗COVID-19的最佳作用位点。因此，清开灵注射液中胆酸、猪去氧胆酸治疗COVID-19的具体作用机制有待进一步研究。

3.2核心靶点表达与COVID-19的关联分析

PPI网络结果显示，得到的12个核心靶点主要涉及细胞凋亡、癌症、炎症、免疫调节等。其中CASP3、CASP8对应蛋白caspase-3、caspase-8属于半胱氨酸蛋白酶家族，与细胞凋亡相关。细胞凋亡可通过3种途径（死亡受体途径、线粒体途径、内质网途径）实现，caspase-8介导死亡受体途径，并激活caspase-3，被激活的caspase-3作用于bcl-2家族成员，破坏宿主细胞内的结构蛋白及DNA稳定，最终导致细胞凋亡[31]。研究表明[32]，冠状病毒感染细胞后，caspase-3、caspase-8被激活从而介导细胞凋亡。

EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，其介导的信号转导与细胞生存、增殖以及分化密切相关。有研究表明，非小细胞肺癌中EGFR存在过表达现象[33]，细胞凋亡受抑。此外，SARS-CoV感染机体后，EGFR信号介导的宿主对肺损伤的过度反应可诱导肺纤维化症状[34]。BCL2L1是bcl-2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子，SARS患者的标志性发现是淋巴细胞减少，BCL2L1在无生长因子的条件下可以抑制SARS-Co V E蛋白诱导的T细胞凋亡[35]。提示抑制EGFR信号或诱导BCL2L1表达可以作为COVID-19诊断和治疗的思路之一。

3.3涉及主要信号通路与COVID-19的关联分析

KEGG通路富集分析结果显示，涉及通路多集中在细胞凋亡、炎症、癌症等方面。其中细胞凋亡通路与病毒感染后的临床表现相关。SARS-CoV可通过多种途径诱导细胞凋亡，如M膜蛋白和N核衣壳蛋白分别通过启动caspase-8、caspase-9以及激活线粒体途径诱导细胞凋亡[36,37]。这些都可能引起SARS-CoV感染后的临床表现。呼肠弧病毒BYD1可能在SARS-CoV感染机体的过程中发挥辅助作用，多器官损伤症状即由其外衣壳蛋白μ-1和细胞黏附蛋白σ-1诱导的细胞凋亡所致[38]。COVID-19发病早期可见外周血白细胞、淋巴细胞计数减少，提示可能与细胞凋亡通路有关。

肥大细胞是免疫致敏因子Ig E必不可少的效应细胞。高亲和力Ig E受体Fc epsilon RI聚集在肥大细胞上，它可以激活肥大细胞以及NF-κB炎症信号通路，诱导肥大细胞脱颗粒并合成促炎细胞因子[39,40]。TNF-α作为促炎因子，可以介导炎症的发生和发展，机体内TNF-α水平上升同样可以激活NF-κB信号通路，促进更多炎症因子和细胞因子的分泌。提示Fc epsilon RI通路和TNF通路可能与SARS-CoV-2诱导的细胞因子风暴有关[41]。

综上，本研究得到清开灵注射液治疗COVID-19的核心成分、相关靶点以及关键通路主要与炎症、细胞因子风暴、免疫、细胞凋亡等有关。其中细胞因子风暴若是不加以干预，可以导致炎症进一步弥散、肺损伤加剧，最后发展为急性呼吸窘迫综合征、多器官衰竭等重型、危重型COVID-19症状[42]。清开灵注射液可以通过发挥抗炎、缓解细胞因子风暴、提高机体免疫力等作用，改善现阶段症状，阻止疾病向重症方向转变。因此，本研究结果符合清开灵注射液应用于疫毒闭肺阶段的临床使用现状，可以为今后的临床用药提供一定依据。

综合分析，发现刺槐素对应的核心靶点基因CASP3、CASP8、FASLG在细胞凋亡通路及TNF通路中均有表达。因此刺槐素等成分通过作用于CASP3、CASP8、FASLG等靶点调节细胞凋亡通路及TNF通路等，可能是清开灵注射液抗COVID-19的作用机制之一。后续研究本课题组拟设计动物体内外药理实验，对清开灵注射液治疗COVID-19的作用机制进行深入探讨，以期为其临床应用和新药研发提供更多参考。

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