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新型冠状病毒肺炎病例的多种生物样本的带毒状况及临床意义

2020-03-03 1212 上传者：管理员

摘要：目的:浅析检测新型冠状病毒肺炎病例多种生物样本的病毒核酸检测结果。方法:采用小样本横断面观察性研究设计，纳入宜宾市第二人民医院。四川大学华西医院宜宾医院2020年2月2日在院隔离治疗的NCP确诊病例，应用实时荧光逆转录聚合酶链反应检测技术，设计针对2019-nCoV-1ab区和N区的2套引物，检测单日采集的咽拭子、血液、粪便、尿液标本的2019-nCoV核酸。结果:共纳入7例输入型普通型NCP病例。7例患者在发热后第3～7天经咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液标本2019-nCoV核酸检测阳性确诊，其中2例在发热后第3天确诊。经治复查时间分别处于各患者发热后的第7～15天，2019-nCoV核酸检测结果显示，5例患者咽拭子检测阴性，其中1例处于发热后第7天；7例患者血液、粪便、尿液中均未检测出2019-nCoV核酸。结论:对于普通型NCP病例，在技术上实时荧光逆转录聚合酶链反应检测可在发病后第3～7天检出2019-nCoV核酸，同时2019-nCoV核酸可在病程第7天开始转阴。普通型NCP病例在病程第7～15天期间的单日血液、粪便、尿液中未检出2019-nCoV核酸。该研究仅为初步的探索性研究，尚需要更高质量的研究来获得更为确定性的依据。

关键词：
2019新型冠状病毒
临床意义
实时荧光逆转录聚合酶链反应
新型冠状病毒肺炎
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新型冠状病毒肺炎最初发生在湖北武汉，初步考虑与野生动物接触感染相关，目前已明确可以人传人[1-2]。2019新型冠状病毒属于冠状病毒科β属，其基因特征与严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒和中东呼吸综合征相关冠状病毒有明显区别。目前研究显示2019-nCoV与蝙蝠SARS样冠状病毒同源性为85%以上[3-4]。体外分离培养时，2019-nCoV在96h左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现。NCP临床表现以干咳、发热为主，但也可隐匿发病[5]，确诊主要依靠实时荧光定量逆转录聚合酶链反应和病毒基因测序。RT-PCR可以检测各种样本中的2019-nCoVRNA，其应用简便，在NCP的诊断和治愈评估中具有重要意义。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》将2019-nCoV核酸RT-PCR确诊检测的生物样本界定为呼吸道标本或血液标本[6]，但目前对其他类型的生物样本的2019-nCoV核酸检测结果缺少报道。本研究拟利用实时荧光定量RT-PCR方法检测NCP患者不同类型生物样本的带毒情况，初步阐述2019-nCoV在患者体内不同系统的分布特点及其临床意义，为2019-nCoV的早期诊断和传播途径分析提供实验室依据。

1、资料与方法

1.1 研究对象

本研究设计为小样本横断面观察性研究。本医院（宜宾市第二人民医院·四川大学华西医院宜宾医院）为NCP定点收治医院，于2020年1月24日接诊首例NCP[7]。本研究纳入接诊首例以来至2020年2月2日本医院收治的所有NCP确诊病例。NCP诊断标准：依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》和《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）》，符合相关流行病学、临床表现，以及咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液检测2019-nCoV核酸阳性[4-5]。本研究经宜宾市第二人民医院·四川大学华西医院宜宾医院生物医学伦理委员会审核，经应急流程获得批准立项（批件号：2020-027-01）。所有纳入病例的个人信息均作匿名化处理。所有纳入本研究的病例均被告知所采集的生物样本仅用于科学研究和疫情防控，个人生物遗传学信息不会泄露。所有观察对象本人均签署了研究知情同意书。所有研究知情同意书纸质文本均密封暂存于隔离病房内。

1.2 生物样本采集

本研究中确诊时呼吸道标本2019-nCoV核酸检测结果为回顾性收集的基线。2020年2月2日主管医生在三级防护条件下，在隔离病房采集NCP患者的咽拭子、血液、粪便、尿液样本作为复查。所有生物样本均严格按标准流程密封转运至本院检验科。

1.3 试剂和仪器

病毒RNA提取试剂盒、荧光定量RT-PCR试剂均为湖南圣湘生物科技股份有限公司提供。采用美国安捷伦科技公司Mxp3000PCR仪进行实时荧光定量PCR扩增。

1.4 引物与荧光探针

引物与荧光探针均由湖南圣湘生物科技股份有限公司提供，有2个靶序列。FAM（ORF-1ab）区域靶标（ORF1ab）：正向引物为CCCTGTGGG-TTTTACACTTAA；反向引物为ACGATTGTGCA-TCAGCTGA；荧光探针为5'-FAM-CCGTCTGCGGTA-TGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'。ROX（N基因）区域：正向引物为GGGGAACTTCTCCTGCTA-GAAT；反向引物为CAGACATTTTGCTCTC-AAGCTG；荧光探针为5'-FAM-TTGCTGCTG-CTTGACAGATT-TAMRA-3'。

1.5 样本预处理与检测

样本预处理所有样本先经过56℃30min灭活。

血清样本（Tris-EDTA缓冲液/生理盐水基质）：取出样本后混匀，加入10μL待测样品和10μL样本核酸释放剂到PCR扩增管中，枪头吹打3～5次，作为待测样本备用。咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液样本（病毒保存液等其他基质）：取出样本后混匀，取100～200μL待测样本于1.5mL离心管中，以离心半径8cm、转速12000r/min离心10min，弃上清液后往沉淀中加入50μL样本核酸释放剂震荡混匀，静置10min，作为待测样本备用。

尿液标本：混匀样本，取500μL样本置1.5mL离心管中，以离心半径8cm、转速12000r/min离心5min后弃上清液，沉淀加入1mL生理盐水混匀重悬，以离心半径8cm、转速12000r/min离心5min弃上清液，沉淀加入50μL核酸释放剂裂解10min。

粪便标本：取黄豆般大小的大便置于1.5mL离心管中，加入1mL生理盐水振荡混匀10s，以离心半径8cm、转速3000r/min离心30s，取200μL上清液置于新的离心管中，以离心半径8cm、转速12000r/min，离心5min，弃上清液，加入1mL生理盐水混匀重悬，以离心半径8cm、转速12000r/min离心10min，沉淀加入50μL核酸释放剂，静置10min。

样本检测：依次加入30μL配制好的PCR混合液和20μL上述处理后样本至PCR反应管，在实时荧光PCR仪上机进行荧光定量PCR扩增检测。所有检查均重复2次，若至少其中1次为阳性即判定为2019-nCoV核酸检测阳性。

1.6 结果评价

先分析内标在HEX通道是否有扩增曲线，且扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数（cyclethreshold，Ct）≤40。①若有，则表示本次检测有效，可继续进行后续分析：A.若FAM或ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，则判定该结果为2019-nCoV核酸检测为阳性；B.若FAM及ROX通道均未检测到典型的S型扩增曲线（未检测到Ct），或Ct>40，则表示2019-nCoV核酸检测为阴性。②若内标在HEX通道没有检测到Ct或Ct>40，则表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新实验。

1.7 统计学方法

本研究为小样本观察性研究，描述性报道事件计数，无假设检验。

2、结果

2.1 病例信息

本研究共纳入观察了7例确诊NCP病例，均为输入型病例，其中男5例，女2例；平均年龄（31.9±9.1）岁；所有病例均以发热为首发症状，伴或不伴呼吸道症状。依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第四版）》，7例均经院内救治专家组会诊评估分型为普通型。经积极治疗无向重型/危重型转化的病例。见表1。

表1 7例患者的基本情况

2.2 检测结果

本研究检测不同生物样本类型的2019-nCoV核酸共41份（表2），2套引物均能较好地扩增出部分标本2019-nCoV基因的特异性片段。

2.2.1 确诊时检测情况

7例患者在发热后第3～7天经咽拭子/痰液/纤维支气管镜灌洗液标本2019-nCoV核酸检测阳性确诊，其中2例在发热后第3天确诊（图1）；确诊时，咽拭子单阳2例，痰液单阳2例，咽拭子和痰液阳性2例，咽拭子和纤维支气管镜灌洗液标本阳性1例。

2.2.2 复查时检测情况

2020年2月2日对在院的7例患者统一进行复查，时间分别处于各患者发热后的第7～15天。经治复查2019-nCoV核酸结果显示，5例患者咽拭子2019-nCoV核酸检测阴性，其中1例处于发热后第7天（图1）；7例患者血液、粪便、尿液中均未检测出2019-nCoV核酸（表2）。

图1 咽拭子2019-nCoV核酸检测结果的时间分布图

表2 不同类型生物样本的2019-nCoV核酸检测结果

3、讨论

本项小样本横断面观察性研究共纳入7例输入型普通型NCP患者，其确诊时间在发热后第3～7天。本研究中经治复查时间分别处于各患者发热后的第7～15天，2019-nCoV核酸结果显示，5例患者咽拭子检测阴性，其中1例在发热后第7天检测2019-nCoV核酸即转阴；7例患者血液、粪便、尿液中均未检测出2019-nCoV核酸。

目前，检测2019-nCoV有多种方法。病原学检测方法（即通过体外培养分离病毒）费时较长，分离阳性率不高。血清学方法需等待患者出现特异性抗体，难以对病毒感染进行早期诊断。实时荧光RT-PCR技术可明显提高2019-nCoV检测的特异性和敏感性。该法可用于检测各类型生物样本（血液、痰液、呼吸道分泌物、粪便和尿液等）中2019-nCoV的RNA。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》提出呼吸道标本或血液标本通过实时荧光RT-PCR检测2019-nCoV核酸阳性是确诊的方法之一，解除隔离出院的实验室标准为间隔至少1d的连续2次呼吸道标本2019-nCoV核酸检测阴性[6]。因此，采用实时荧光RT-PCR检测技术在2019-nCoV的早期诊断和救治效果评价中具有重要临床意义。

2020年1月24日，根据疫情防控需要，四川省依法依规及时启动重大突发公共卫生事件一级响应，全省网格化排查入川人员，以及早期全面部署预检分诊、发热门诊和定点收治医院。因此，这一系列强有力的防控措施实现了输入型NCP病例“早发现、早报告、早隔离、早治疗”的落实。本研究提示实时荧光RT-PCR检测在技术上可实现输入型普通型NCP病例的早期检出。有未发表数据提示有在发病后第1天即检出2019-nCoV核酸的病例。输入型NCP病例的重型/危重型的比例在国内普遍较低，与在严防严控的情况下实现了早诊断和早治疗有一定关系。也因为实现了早诊断和早治疗，本研究观察病例均无向重型/危重型转化的倾向，而且1例早在发热后第7天即2019-nCoV核酸检测转阴，转归良好。

本研究对同一患者同一时间不同种类生物样本的2019-nCoV核酸进行了检测，以观察2019-nCoV在呼吸道、循环系统、消化道、泌尿道的分布情况。普通型NCP患者随着机体免疫系统的较快激活和增强，体内病毒被清除或抑制在低水平，因此有的病例也呈现2019-nCoV核酸检测早期转为阴性。除呼吸道标本外，NCP病例的其他生物样本行2019-nCoV核酸检测少有报告。本研究在普通型NCP病例血液标本中未检出2019-nCoV核酸，逆向推测若血液中检出2019-nCoV核酸是否为重型/危重型的预测指标需要进一步的研究探索。此外，本研究在普通型NCP病例粪便和尿液标本中未检出2019-nCoV核酸，2019-nCoV是否侵入普通型NCP病例的消化道和泌尿道需要更进一步的研究，普通型NCP病例是否成为粪口传播的传染源亦需要进一步的研究。但有新闻媒体报道NCP病例粪便中可检出2019-nCoV核酸，因此为探究2019-nCoV的传播途径，四川省卫生健康委员会于2020年2月6日启动了全省定点收治医院开展NCP病例的粪便2019-nCoV核酸检测项目。此项政府主导的多中心研究有助于阐明2019-nCoV是否经粪口途径传播。

本研究仅为初步探索性分析，因此存在一些不足之处：①纳入病例数很少，因此若分别开展湖北内和湖北外的多中心研究，则能得到更为确定性的研究结果；②缺少重型/危重型病例，因此同样建议在湖北内和湖北外纳入重型/危重型进行此类多类型生物样本的检测分析；③观察时间点不统一，本研究为单日的横断面研究设计，因此病例分别处于病程中不同时间点，异质性较大；④缺少连续观察，病例追踪时间短，若采用前瞻性队列研究设计动态观察早期、中期、远期同一时间点2019-nCoV核酸检测结果则更具有分析价值，尤其是病程初期和后期的血液、粪便、尿液标本检测目前缺少相关探索性研究；⑤本研究复查咽拭子2019-nCoV核酸阴性者达5例，因而其同一时点血液、粪便、尿液检测阴性的可分析价值相对较为有限，建议纳入更多咽拭子2019-nCoV核酸阳性的病例同期检测其多种生物样本的2019-nCoV核酸；⑥最后，目前检测手段尚需继续完善，以减少假阴性结果导致的分析和判断受影响。

综上所述，本项纳入普通型NCP病例的小样本横断面观察性研究发现，对于普通型NCP病例，实时荧光RT-PCR检测在技术上可在发病后第3～7天检出2019-nCoV核酸，同时2019-nCoV核酸可在病程第7天开始转阴。普通型NCP病例在病程第7～15天期间的单日血液、粪便、尿液中未检出2019-nCoV核酸。本研究仅为初步的探索性研究，尚需要更高质量的研究来获得更为确定性的结论。

参考文献：

[1]中华人民共和国国家卫生健康委员会.《国家卫生健康委关于新型冠状病毒肺炎暂命名事宜的通知》国卫医函〔2020〕42号.(2020-02-07)[2020-02-07].

[2]中华人民共和国国家卫生健康委员会.《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第三版)》.(2020-01-22)[2020-01-22].

[3]中华人民共和国国家卫生健康委员会.《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第四版)》.(2020-01-27)[2020-01-27].

[4]中华人民共和国国家卫生健康委员会.《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》.(2020-02-05)[2020-02-05].

[5]李进,李文全,聂滨,等.输入型难辨性新型冠状病毒肺炎一例及传播模式分析.华西医学,2020,35(2):137-140.

施绍瑞,聂滨,郭渝,罗立,张林琳,李文全,鲜龚兵,吴家亮,林春兴,陈心足. 新型冠状病毒肺炎病例多种生物样本的病毒核酸检测结果[J]. 华西医学,2020,35(02):132-136.