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细胞免疫功能对新型冠状病毒肺炎重症确诊患者的临床及预后评估价值

2020-05-16 334 上传者：管理员

摘要：目的：探讨新型冠状病毒肺炎重症患者的细胞免疫功能特征及其预后评估价值的队列研究。方法：采用队列研究的方法，收集武汉大学人民医院东院收治的119例重症患者的临床资料，其中男60例（50.4%）、女59例（49.6%），平均年龄（60.9±14.2）岁。以在院死亡为随访的主要终点，入院后30d内疾病转归评估分型为随访的次要终点，分析细胞免疫功能与COVID-19临床及预后的相关性。结果：22例患者死亡，47例随访期内评估为重/危重型。生存组与死亡组主要终点事件中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+计数的差异有统计学意义（均P<0.05），普通组和重/危重症组次要终点事件中CD3+、CD4+、CD8+、CD19+计数的差异有统计学意义（均P<0.05）。结论：细胞免疫功能对COVID-19具有良好的临床及预后评估价值。

关键词：
新型冠状病毒肺炎
细胞免疫
队列研究
预后
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2019新型冠状病毒疫情蔓延，现已成为全球大流行。2020年1月，新疆首批重症医疗队作为首支援助医疗队参与2019新型冠状病毒肺炎定点医院武汉大学人民医院东院区救治工作，疆鄂联队一起对疾病诊疗，积累经验，不断加深对COVID-19的认识。既往研究[1-3]显示，细胞免疫功能在各种类型、各年龄段肺炎中均发挥重要作用，针对重症急性呼吸综合征研究[4]中，同样发现患者免疫力低下和系统性炎症的表现。本研究收集确诊患者的临床资料，结合细胞免疫进行汇总分析，对COVID-19的临床及预后价值进行评估。

1、资料与方法

1.1临床资料

选择2020年1月30日至2月18日在武汉大学人民医院东院区确诊为COVID-19重症患者119例，随访30d，即研究时间段为2020年1月30日至3月19日。收集患者临床资料，包括年龄、性别、生命体征、体重指数（BMI）、临床症状、吸烟史；记录患者临床指标，定义为入院后首次实验室相关检查，包括血常规、血生化、炎症因子、纤溶指标、细胞免疫功能等检查。

纳入标准：符合《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》确诊标准的重症患者。排除标准：（1）既往接受免疫支持或抑制治疗；（2）妊娠期妇女；（3）<18岁青少年；（4）近3个月内接受过手术；（5）合并其它感染性疾病或血液病；（6）未在入院后当日或次日及时完善细胞免疫功能检测。

1.2检测方法

采用CytoFLEX流式细胞仪检测细胞免疫功能。具体包括CD3+百分比、CD3+计数、CD4+百分比、CD4+计数、CD8+百分比、CD8+计数、CD4+/CD8+、CD19+百分比、CD19+计数、CD16++CD56+百分比、CD16++CD56+计数。

1.3随访

本研究主要通过住院期间对患者进行随访，以入院日期为随访起点，以出院前患者发生院内死亡为主要终点，以入院期间30d内疾病转归评估分型（普通型、重型/危重型）为随访的次要终点。

1.4统计学分析

x使用SPSS22.0软件建立数据库并进行统计分析。符合正态分布的连续性变量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。不符合正态分布的连续性变量资料采用中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料采用频数和百分比表示，组间比较采用卡方检验。通过受试者工作特征（ROC）曲线评估CD值对COVID-19临床及预后评估价值。P<0.05为差异有统计学意义。

1.5伦理审查与临床试验注册

此研究严格遵守武汉大学人民医院伦理委员会批准的方案执行（批准号WDRY2020-K131），并在中国临床试验注册中心注册，注册号为CHiCTR2000030494。研究内容通过武汉大学人民医院科教处审核。

2、结果

2.1一般基线资料

本研究共纳入119例COVID-19重症患者，其中男60例（50.4%）、女59例（49.6%），平均年龄（60.9±14.2）岁。其中首发症状表现为发热71例（59.7%），咳嗽23例（19.3%），乏力13例（10.9%），其它症状如纳差、腹泻、肌肉酸痛等12例（10.1%）。

2.2临床及预后随访结果

在随访期间内，生存组与死亡组主要终点事件临床指标包括中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、C反应蛋白、超敏C反应蛋白、天冬氨酸转氨酶（AST）、尿素、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、D-二聚体的差异有统计学意义（均P<0.05）。普通组与重/危重组次要终点事件临床指标（白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、C反应蛋白、超敏C反应蛋白、AST、白蛋白、总胆红素、直接胆红素、尿素、HDL-C、D-二聚体）差异有统计学意义（均P<0.05））；见表1。

表1临床及预后基线资料比较［/例（%）］

2.3细胞免疫功能差异分析

根据流式细胞仪检测结果分析，将所有患者细胞免疫功能淋巴细胞亚组百分比和计数，即CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD16++CD56+进行分析，主要终点事件中CD3+计数、CD4+计数、CD8+计数、CD19+计数生存组与死亡组的差异有统计学意义（均P<0.05）。次要终点事件中CD3+计数、CD4+计数、CD8+计数、CD19+计数普通组和重/危重症组的差异有统计学意义（均P<0.05）；见表2。

表2119例患者的细胞免疫功能差异分析（x±s）

2.4ROC曲线分析对死亡患者CD计数值进行ROC曲线分析，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+的曲线下面积（AUC）依次为0.199、0.200、0.196、0.313（均P<0.05）。其值越低发生死亡的风险越高，对生存患者的预测价值可达0.801、0.800、0.804、0.687；对重症患者CD计数值进行ROC曲线分析，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+的AUC依次为0.096、0.100、0.124、0.310（均P<0.05））。其值越低发生重/危重型的风险越高，对普通型患者的预测价值可达0.904、0.900、0.876、0.690。由此可见入院后首次细胞免疫分析对COVID-19重症患者院内死亡和重/危重症转归评估具有预测价值；见表3、表4。

表3死亡患者细胞免疫功能ROC曲线分析

表4重/危重症患者细胞免疫功能ROC曲线分析

3、讨论

病毒是一种个体微小、结构简单、依赖宿主活细胞寄生并增殖的非细胞生命形态，人体免疫系统的特异性免疫和非特异性免疫在清除病毒过程中发挥至关重要的作用[5]。免疫系统作为人体抵抗病原微生物的重要防线，其强弱在一定程度上决定了人体的患病状况和预后情况[6]。抗病毒免疫包括细胞免疫、体液免疫等机体免疫模式，其中细胞免疫是清除细胞内寄生微生物最为有效的防御反应。广义的细胞免疫包括T细胞、B细胞和NK细胞介导的免疫应答。

《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[7]、《新型冠状病毒肺炎重型、危重型病例诊疗方案（试行第三版）》[8]对于重型、危重型临床预警指标均涉及外周血淋巴细胞进行性下降。淋巴细胞可分为T细胞、B细胞和NK细胞，淋巴细胞亚群失衡是反映机体免疫应答的重要指标[9]。呼吸道传播病毒入侵气道上皮细胞，经抗原识别呈递加工激活T细胞，产生抗病毒因子，如白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、趋化因子（包括体内平衡趋化因子和促炎趋化因子）和细胞毒性分子（穿孔素和颗粒酶B）广泛参与机体免疫反应。B细胞作为专职抗原呈递细胞，分布在淋巴结和脾脏，调节T细胞亚群及树突状细胞功能，在抗原刺激下可分化为浆细胞，执行机体体液免疫。NK细胞不同于前两者，无需预先致敏，非特异性杀伤病毒感染细胞。武汉大学人民医院东院已将流式细胞仪淋巴细胞亚型分析作为常规检查项目。除CD3+、CD4+、CD8+T细胞外，还包括参与B细胞活化增殖的CD19+细胞和反映NK细胞功能的CD16+、CD56+细胞，这些细胞免疫指标是本研究的循证基础。

HIV感染患者常出现CD4+T细胞和CD4+/CD8+比值下降[10]。SARS患者急性期外周血CD3+、CD4+和CD8+T细胞绝对数显著下降[11]。有学者推测COVID-19导致患者外周血CD4+T细胞下降的具体机制可能有：（1）病毒直接损伤，但不侵入细胞；（2）病毒直接侵入细胞，并将其当作宿主细胞；（3）启动炎性反应，分泌大量细胞因子，导致细胞消耗过多或抑制细胞分化和生成[12]。住院患者潜伏期过后出现首发症状持续时间多在1～2周，此时显示病毒已经导致患者外周血细胞免疫检测出现异常。

通过对119例重症患者的分析，结果显示死亡患者和重/危重患者的细胞免疫指标显著低于生存患者和普通型患者。这与近期其他团队外周血淋巴细胞亚型分析相关研究结果一致[13-15]。通过单细胞RNA序列结合TCR测序对COVID-19患者支气管肺泡灌洗液免疫微环境分析，重症患者CD8+细胞克隆数目显著下降，轻症患者CD8+细胞高度扩增[16]。在对1例COVID-19进行病理解剖中发现[17]，外周血CD4+及CD8+T细胞数量虽然大幅降低，但状态却被显著激活。CD4+T细胞中具有高促炎效应的Th17细胞数量增加，CD8+T细胞则呈现高颗粒酶细胞毒性。如何通过淋巴细胞亚型分析进行风险预测，阻止细胞因子风暴发生，改善患者预后至关重要。本研究ROC曲线显示入院后首次细胞免疫分析即CD+细胞计数（CD3+、CD4+、CD8+、CD19+）对COVID-19患者院内死亡和重/危重症评估具有显著预测价值。

当前，重症患者权威诊疗方案[7-8]推荐中药、胸腺肽α1、人免疫球蛋白、康复血浆等免疫支持治疗。对于已发生细胞因子风暴危重症患者采用托珠单抗和血液净化治疗。临床显示治疗过程可以提升细胞免疫指标，故本研究入选人群为入院当日或次日行此项检测患者。COVID-19危重型病死率接近50%[18]。此时患者免疫系统已经完全紊乱，体内会因IL-6、IL-10、巨粒细胞-噬细胞集落刺激因子等为主的炎性因子大量产生而出现细胞因子风暴，从而导致全身性炎症反应，致多器官衰竭甚至死亡[19]。细胞因子风暴发生迅速，这也是重型患者极易在极短时间内发展成为危重型患者的原因。在COVID-19重型患者的治疗中，增加细胞因子这一免疫学特征的检测，根据检测结果使用相应的免疫治疗策略来阻止细胞因子风暴的发生，很可能会有效改善患者的疾病状况。此外，疫苗研制的原理也正是保留病原微生物的特性，在不引起人体患病的情况下激活机体的免疫系统，产生特异性抗体和效应T细胞，并产生记忆B细胞和记忆T细胞来建立免疫保护[20]。

本研究是一个单中心研究，纳入患者数量相对较少，混杂因素控制相对困难，结果需要多中心大样本研究进一步验证。其次，本研究随访时间相对较短，无法评估患者远期预后。

综上所述，本研究通过对119例COVID-19重症患者的随访，以在院死亡为随访的主要终点，入院后30d内疾病转归评估分型为随访的次要终点，发现细胞免疫功能对COVID-19具有良好的临床及预后评估价值，在疫情全球化蔓延的当今值得在临床上引起重视。

参考文献：

[1]李娜,穆亚平,陈静,等.淋巴细胞亚群绝对计数对儿童难治性肺炎支原体肺炎的早期预测作用.中国当代儿科杂志,2019,21(6):511-516.

[2]国家卫生健康委办公厅.关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)的通知.中华人民共和国国家卫生健康委员会,2020-03-03.

[3]中央赴湖北等疫情严重地区指导组.关于进一步完善新型冠状病毒肺炎重型､危重型病例诊疗方案的通知.中央指导组,2020-03-03.

[4]李婕,李怡,冯瑞琳,等.昆明HIV感染吸毒者CD4+T淋巴细胞水平与CD4/CD8比值调查分析.国际病毒学杂志,2019,26(3):157-160

[5]李建国,陈瑞,魏菁.SARS患者急性期外周血CD3+､CD4+及CD8+细胞数量的变化.免疫学杂志,2004,20(5):382-384.

[6]张益明,高世定,王占科,等.3例新型冠状病毒肺炎患者外周血CD4+T淋巴细胞和CD4+/CD8+比值变化.国际检验医学杂志,2020.

[7]卢子龙,何如愿,江文洋,等.COVID-19患者临床特征及免疫功能分析.武汉大学学报(医学版),2020.

陈铀,罗豫川,王开杰,曹辉,吕建宏,郑剑,徐亚青.新型冠状病毒肺炎重症患者的细胞免疫功能特征及其预后评估价值的队列研究[J/OL].中国胸心血管外科临床杂志:1-6[2020-05-15].