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急性髓系白血病患者T细胞中PD-1、TIM-3、VISTAT的表达及影响分析

2020-06-19 311 上传者：管理员

摘要：目的:研究多种负性共刺激分子在急性髓系白血病(AML)患者外周血T细胞上的表达及其对预后的影响。方法:收集初治、完全缓解(CR)、未缓解(NR)AML患者外周血标本,采用流式细胞术检测CD4+和CD8+T细胞PD-1、VISTA、TIM-3的表达水平,并收集患者临床资料进行统计分析。结果:初治AML组患者CD4+和CD8+T细胞PD-1、VISTA、TIM-3表达水平均较对照组显著增高(P<0.05),CR组CD4+和CD8+T细胞PD-1、TIM-3、VISTA表达水平均较初治组及NR组显著降低(P<0.05);初治AML患者CD4+和CD8+T细胞TIM-3表达水平与VISTA表达水平正相关(r=0.85,r=0.73);初治AML患者,首次诱导化疗未缓解组及高危组患者CD4+T细胞PD-1、VISTA表达水平显著上升(P<0.05),高危组CD8+T细胞TIM-3表达水平显著上升(P<0.05),CBFβ-MYH11突变阳性组CD8+T细胞VISTA表达水平显著降低(P<0.05)。结论:PD-1、TIM-3、VISTA在AML外周血T细胞上的表达可能参与AML的免疫逃逸,并可能成为急性髓系白血病患者的治疗靶点。

关键词：
PD-1
T细胞
VISTA
免疫逃逸
免疫靶点抑制剂
急性髓系白血病
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急性髓系白血病（acutemyeloidleukemia,AML）是一种常见的血液系统恶性肿瘤，其患者死亡率较高，且病因复杂，其中免疫逃逸参与肿瘤的发生发展。负性共刺激分子提供负性调控信号，限制、终止或减弱T细胞应答，参与肿瘤免疫逃逸。本研究观察了AML外周血T细胞的程序性死亡受体-1(PD-1）、T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3）及含有T细胞活化的免疫球蛋白抑制剂的V结构域（VISTA）这3种负性共刺激分子的表达情况，旨在为免疫靶点抑制剂治疗AML提供一定的实验依据。

一、材料和方法

病例资料

2019年4月至2019年11月在徐州医科大学附属医院血液科住院的AML患者81例，所有患者临床诊断均符合成人急性髓系白血病中国诊疗指南（2017年版）。初诊AML患者38例（男26例，女12例），中位年龄57岁。复诊AML患者43例，其中完全缓解患者（CR)25例（男11例，女14例），中位年龄49岁；未缓解（NR）患者18例（男11例，女7例），中位年龄53岁。所有复诊患者排除造血干细胞移植者。正常对照组均为健康志愿者，共17例（男8例，女9例），中位年龄38岁。所有组间患者性别、年龄均无显著性差异。

试剂和仪器

BV421标记的CD3抗体、BV605标记的CD4抗体、PE标记的CD8抗体、FITC标记的PD-1和Alexa647标记的TIM-3抗体抗体均购自美国BD公司。Alexa700标记的VISTA抗体购自美国R&DSystems公司。流式细胞分析溶血素（BDFACSTMLysingSolution）购自美国BD公司。流式细胞仪购自美国BectonDickinson公司。

标本的处理

采集受试者清晨空腹状态外周静脉血3ml，肝素钠抗凝，所有血液标本在4h内上机检测。取1个干燥流式管，分别标记姓名、性别、年龄，用移液器向流式管中加入100μl全血，然后管中依次加入5μlCD3、CD4、CD8、PD-1、VISTA、TIM-3抗体，置于4℃避光孵育15min，进行细胞表面抗原染色。将去离子水与溶血素按9∶1比例稀释，接着向管中加入2ml已经稀释好的溶血素，迅速混匀，室温避光静置10min，观察溶液透亮。向管中加入2mlPBS溶液洗涤细胞，以600×g离心3min，去上清。加入1mlPBS溶液制成工作液，上机检测。每管至少收集10000个T细胞，用Flowjo软件分析数据及各负性共刺激分子的表达水平。

统计学分析

采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料均经Shapiro-Wilk检验，正态分布资料，两组间比较采用两样本t检验、Pearson相关性分析；非正态资料，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验、Spearman相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

各负性共刺激分子在初治AML患者外周血T细胞上的表达水平

初治AML患者CD4+T、CD8+T细胞PD-1、TIM-3、VISTA表达水平均较健康对照组显著增高，差异有统计学意义（表1）。

各负性共刺激分子在复诊AML患者外周血T细胞上的表达水平

CR组AML患者CD4+T、CD8+T细胞PD-1、TIM-3、VISTA表达水平均较初治AML组及NR组AML患者显著降低（表2）。

各负性共刺激分子在AML患者外周血T细胞上表达的相关性

初治AML患者CD4+T细胞上，TIM-3表达与VISTA表达呈正相关（P=0.001,r=0.65）（图1）。CD8+T细胞上，TIM-3表达与VISTA表达呈正相关（P=0.001,r=0.73）（图2）。而CD4+T、CD8+T细胞上PD-1与TIM-3、VISTA均无相关性。

AML患者外周血T细胞上各负性共刺激分子表达水平和临床指标的相关性

初治AML患者首次诱导化疗后未缓解组及高危组CD4+T细胞PD-1、VISTA表达水平显著上升，CD4+T细胞TIM-3与Hb水平呈负相关（P=0.025r=-0.364）（表3）。高危组CD8+T细胞中TIM-3表达水平显著上升，CBFβ-MYH11突变阳性组CD8+T细胞VISTA表达水平显著下降（P<0.05）（表4）。

三、讨论

程序性死亡受体-1(PD-1）在T淋巴细胞、B淋巴细胞，树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞上均有表达，当PD-1与其配体PD-L1结合，PD-1的胞质内免疫受体酪氨酸抑制基序可招募胞内的SHP-2并磷酸化下游的蛋白，最终抑制淋巴细胞增殖及细胞因子产生并诱导细胞分裂周期停滞[1,2]。Pembrolizumab是一种全人源性IgG4型抗PD-1单克隆抗体，其已被证实在多种实体肿瘤中具有良好的耐受性，2017年3月pembrolizumab被FDA批准治疗成人和儿童复发难治性霍奇金淋巴瘤及3线以上治疗后复发的患者[3]。综上所述，负性共刺激分子抑制剂在血液系统疾病中具有治疗前景。目前，关于AML外周血上多种负性共刺激分子表达的研究较少，本研究发现，初治AML患者外周血CD4+T、CD8+T细胞PD-1较健康对照组均有明显升高，CR组CD4+T、CD8+T细胞PD-1表达水平较初治及NR组均有所下降，这提示，AML外周血T细胞上也存在PD-1的过表达，并和疾病的状态有关。本研究进一步分析了PD-1表达水平与患者诊断时临床特征和疾病缓解率、危险度分层、基因突变等预后因素的相关性，结果显示，初治AML患者CD4+T细胞PD-1表达水平和首次诱导化疗疗效及危险度分层有关，首次诱导CR组的CD4+T细胞PD-1表达水平均较NR组显著下降，良好或中等危险组CD4+T细胞PD-1表达水平均较高危组显著下降。以上结果提示，PD-1表达水平与AML预后相关。

负性共刺激分子介导的T细胞功能障碍机制非常复杂，仅中断PD-1/PD-L1并不能完全恢复T细胞功能，在实体瘤治疗中，PD-1抑制剂的临床有效率仅约18%-40%[4]，这提示，其中还涉及其他负调控途径[5]。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3）在Th1、细胞毒性T细胞、NK细胞、单核细胞、DC细胞以及Th17细胞上均表达，半乳糖凝集素-9(Galactin-9）是TIM-3的主要配体。有研究显示，galectin-9与TIM-3的结合可诱导Th1细胞凋亡并抑制其IFN-γ的分泌，这表明，TIM-3是Th1驱动的免疫反应负调节剂，其会导致机体的免疫耐受[6]。本研究结果显示，TIM-3在初治AML患者CD4+T、CD8+T细胞上表达水平较健康对照组显著增高，CR组CD4+T、CD8+T细胞TIM-3表达水平较初治组及NR组均显著下降，这和PaolaDama等[7]研究相符，再进一步分析TIM-3和AML临床特征的关系，结果显示，初治AML患者随着患者危险度的增加CD8+T细胞TIM-3表达水平显著增加。这提示，TIM-3与AML预后相关，这为初诊或难治AML患者的治疗选择提供了思路，为在AML治疗期间加入针对galectin-9/TIM-3途径的抗体提供了理论依据。有研究发现，CD4+T细胞Tim-3的较高表达水平与FLT3-ITD突变显着相关[8]，本研究病例中，无FLT3-ITD突变，无法统计。本研究结果显示，TIM-3与CBFβ-MYH11、AML1-ETO突变无明显相关。这提示，TIM-3与AML预后相关，后续仍需加大样本量及延长随访时间，并完善细胞因子方面研究。

在健康人中，含有T细胞活化的免疫球蛋白抑制剂V结构域（VISTA）主要在造血组织中表达，CD4+T和CD8+T细胞也存在VISTA的低水平表达，但VISTA不在B细胞（CD19+）或CD56hiNK细胞上表达[9]。髓源抑制性细胞（MDSC）是骨髓来源的一群异质性细胞，其具有抑制T细胞抗肿瘤反应的能力[10],AML患者MDSC的VISTA表达上调，通过特异性siRNA抑制VISTA可有效降低MDSC介导的对AML患者CD8+T细胞活性抑制作用，这表明，VISTA对T细胞有抑制作用[11]。本研究结果显示，初治AML患者CD4+T、CD8+T细胞上，VISTA表达水平较健康对照组均显著升高。AML患者CR组CD4+T、CD8+T细胞VISTA表达水平较初治组及NR组均有所下降，进一步分析VISTA和AML临床特征的关系，结果显示，良好或中等危险组CD4+T细胞VISTA表达水平均较高危组显著下降,且CD8+T细胞VISTA低水平表达和CBFβ-MYH11显著相关。这提示，VISTA或许通过影响T细胞功能调控AML的发生发展，与AML预后相关，后续会进一步研究VISTA调节T细胞功能的分子生物学机制。

负性共刺激分子可导致T淋巴细胞耗竭，使细胞免疫功能受损，进而使机体免疫功能受抑制，本研究未具体检测患者总体T淋巴细胞数量，后续可进一步完善。CD4+、CD8+T在免疫过程中相互作用，共同促进机体吞噬杀伤病原体或肿瘤细胞，本研究结果显示，急性髓系白血病患者CD4+T细胞VISTA表达水平较CD8+T细胞上表达下降，差异有显著意义,而PD-1、TIM-3在CD4+、CD8+T细胞上表达差异不显著，进一步研究显示，CD4+T细胞PD-1、VISTA和CD8+T细胞TIM-3表达水平的增高和预后不良有关，这可能成为关键的诊断或预后生物标志物，并可提出更有效的治疗策略。

在多种实体瘤小鼠中，随着肿瘤细胞VISTA的表达肿瘤的生长速度加快，持续阻断VISTA途径可增强T细胞抗肿瘤反应并减慢肿瘤进展[12,13]。有一项关于胃癌的研究显示，肿瘤细胞的VISTA表达水平与肿瘤细胞中的PD-L1表达水平呈正相关，这提示，胃癌肿瘤可能通过VISTA/PD-L1/PD-1双重协同机制来逃避免疫系统的监视，对VISTA和PD-1途径的联合抑制可协同提高T细胞抗肿瘤活性[14]。有研究显示，实体瘤或AML患者MDSCs上PD-1、PD-L1、VISTA表达有相关性，本研究结果显示，各负性共刺激分子在T细胞上表达具有一定的相关性，初治AML外周血CD4+T、CD8+T细胞VISTA表达水平均与TIM-3正相关，但PD-1与TIM-3、VISTA均无相关关系,这提示，在AML患者中，各负性共刺激分子表达可能存在一定的关联，VISTA和TIM-3靶点抑制剂联合应用或许会更加有效。外周血T细胞上各负性共刺激分子的相关性如何及其对预后的影响仍需进一步研究，这对免疫抑制剂的进一步联合使用具有重要提示意义。

参考文献：

[3]陈梦婕,钱素英.PD-1/PD-L1抑制剂在淋巴瘤治疗中的研究进展.中国肿瘤临床,2018;45(10):535-538

葛梦君,徐开林,许婷,唐亚男,李振宇,闫志凌,孙海英,程海,朱锋,桑威,黄一虹,邱婷婷,李德鹏.PD-1､TIM-3､VISTA在急性髓系白血病患者T细胞上的表达及意义[J].中国实验血液学杂志,2020,28(03):748-752.