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掺氮碳量子点用于柳氮磺吡啶的快速检测

2024-07-11 148 上传者：管理员

摘要：以微波法一步合成制备出荧光性能强、荧光量子产率为89.38%的掺氮碳量子点(N-CDs)，并通过荧光猝灭法建立了快速准确测定柳氮磺吡啶(SSZ)的新方法。通过透射电子显微镜、傅里叶红外光谱对碳量子点进行表征，结果显示N-CDs的平均粒径为2.91 nm，主要由C、O、N元素组成，大量羰基、羟基和羧基存在于N-CDs表面。在最佳条件下，柳氮磺吡啶浓度在0.1～2μmol/L和3～200μmol/L范围内线性良好，检出限为0.2μmol/L。将所建方法用于柳氮磺吡啶肠溶片中柳氮磺吡啶含量的测定，回收率为97.3%～102%。

关键词：
微波法
掺氮碳量子点
柳氮磺吡啶
磺胺抗菌药
荧光猝灭
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柳氮磺吡啶（SSZ）是一种广谱类磺胺抗菌药，常用于强直性脊柱炎、溃肠性结肠炎和类风湿性关节炎等疾病的治疗[1]，过量使用会发生恶心、呕吐、血小板减少、肝脏坏死、甚至男性不育等严重症状[2]，用量过少则达不到治疗效果。因此检测分析柳氮磺吡啶含量，对于疾病的治疗及不良症状的避免有重要的指导作用，具有重大临床意义。比色法[3]、电化学法[4]、高效液相色谱法[5,6]、荧光法[7]、薄层色谱法[8]均可用于SSZ含量的检测，但这些方法在使用过程中因样品预处理复杂、灵敏度低等原因受到限制。

碳量子点（CDs）是一种单分散的零维新型纳米荧光材料[9]，其表面活跃、容易进行功能化修饰，具有稳定性好、水溶性高、生物相容性好等优点[10]，常用于药物分析检测。研究显示，杂原子（N、S等）的加入能改变CDs中的导带和价带位置，进而提高CDs的荧光性能[11]。其中，N掺杂CDs(N-CDs）由于新功能位点的出现，以及量子产率高等独特优势引起了广泛的研究兴趣[12]。本文以柠檬酸、焦性没食子酸和三羟基氨基甲烷为原料，采用一步微波法制备了荧光性能良好的掺氮碳量子点（N-CDs），基于柳氮磺吡啶对N-CDs的强荧光猝灭作用，以及柳氮磺吡啶浓度与荧光猝灭程度间的线性关系，构建了一种N-CDs测定柳氮磺吡啶的新方法，并将其用于实际样品中柳氮磺吡啶的测定。

1、实验部分

1.1仪器及试剂

JEM-2100F透射电子显微镜（TEM，日本日立公司）；LS-55荧光分光光度计（美国PE);IR-440傅里叶红外光谱仪（日本岛津公司）；UV-2550紫外可见分光光度计（上海岛津国际贸易有限公司）；YC-330医用冷藏箱（青岛澳柯玛超低温冷冻设备有限公司）；MM823LA6-NS美的微波炉（广东美的微波电器制造有限公司）。

三羟基氨基甲烷（Tris，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；焦性没食子酸（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）；磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液（p H 7.00）；柠檬酸（分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司）；柳氮磺吡啶肠溶片（上海信谊天平药业有限公司）；实验用水均为超纯水。

1.2碳量子点的合成

称取柠檬酸1.066 g，没食子酸0.100 g,Tris 0.608 g，用10 m L超纯水溶解于100 m L烧杯中，超声10 min后置于微波炉中。调节功率为高火，反应5 min。待溶液由淡黄色变为粘稠的深褐色，表明碳量子点已合成。反应完全后，冷却至室温，加入20 m L去离子水至烧杯中，所得深褐色液体即为N-CDs溶液。10 000 r/min离心15 min后，将上层清液用0.22µm的滤膜过滤，收集滤液并用透析袋（1 000 Da）透析24 h，即得到N-CDs，于4℃冰箱中保存备用。该量子点的激发波长为325 nm，荧光量子产率（硫酸奎宁为参比）为89.38%。相比已有文献[13,14]，本合成方法简单、成本低、耗时短、荧光量子产率高、性能良好，是碳量子点合成方法的优选方法。

1.3实验方法

在10 m L比色管中，依次加入800µL稀释100倍的N-CDs溶液、1.00 m L p H 7.0的KH2PO4-Na OH缓冲溶液和适量的柳氮磺吡啶标准溶液，加超纯水稀释至10 m L，室温下静置20 min。在λex=325 nm，λem=410 nm处测定荧光猝灭强度ΔIF（ΔIF=IF0-IF,IF0为未加入柳氮磺吡啶的体系的荧光强度，IF为加入柳氮磺吡啶标准溶液后体系的荧光强度）。

2、结果与讨论

2.1 N-CDs的结构及形貌表征

N-CDs的高分辨率透射电镜图（图1）显示，N-CDs呈类球形，尺寸均一，晶格条纹明显，晶格尺寸为0.21 nm（插图）。粒径统计结果表明N-CDs尺寸主要分布在1.53～4.46 nm范围内，平均粒径为2.91nm。

图2为N-CDs的FT-IR图，3 373 cm-1处的特征峰是O—H的伸缩振动和酰胺键中N—H的伸缩振动，2 939 cm-1处对应C—H的伸缩振动，1 728 cm-1处出现的峰为酯键中羰基的伸缩振动。1 666 cm-1处为C=O的伸缩振动峰，1 537 cm-1和1 458 cm-1两处的特征峰分别对应酰胺键中N—H的弯曲振动和C=C的伸缩振动。1 242 cm-1处为C—O的伸缩振动峰。在1 055、771、606 cm-1处的吸收峰证明N-CDs中的苯环结构未被破坏[15]。以上结果表明CDs中成功掺杂了N，大量的羰基、羟基和羧基存在于N-CDs表面，因此N-CDs具有良好的水溶性和稳定性。

图1 N-CDs的TEM和粒径分布图

2.2 N-CDs的光学性质

图3为N-CDs的荧光光谱图和紫外-可见吸收光谱，其中，N-CDs在334 nm处（红线）的特征吸收峰可能是C=O产生的n-π*跃迁所致[16]。N-CDs的最佳激发（紫色）和发射（蓝色）波长分别为325 nm和410 nm。在最大吸收波长334 nm处激发时，N-CDs发出较强荧光，说明N-CDs内部的共轭结构是有效的荧光发射中心。激发波长与发射波长之间存在85 nm的Stokes位移，N-CDs在最大激发波长325 nm处的激发光谱和发射光谱峰形对称，无背景干扰，说明N-CDs能发射强而稳定的荧光[17]。图4显示，当N-CDs激发波长从290 nm增加到370 nm时，N-CDs的荧光强度先增加后减小，且发射峰逐渐红移，这可能与N-CDs的尺寸效应或不同表面发射陷阱的光学选择有关[18]。在325 nm激发波长下，N-CDs在410 nm处的荧光发射峰强度最大。

图2 N-CDs的FT-IR光谱

图3 N-CDs的紫外吸收光谱和荧光光谱图

SSZ在N-CDs的最大激发波长（325 nm）下无荧光，当SSZ加入到N-CDs水溶液中时，N-CDs的荧光强度急剧下降，SSZ对N-CDs有很强的猝灭效果（图5），表明N-CDs可用于SSZ测定。

图4不同激发波长下N-CDs的荧光光谱图

图5 N-CDs、SSZ、N-CDs+SSZ的荧光发射图谱

2.3条件优化实验

2.3.1反应介质及p H值

向N-CDs溶液中加入SSZ后，体系的荧光猝灭程度在酸性条件下（p H<6.02）逐渐增加，在碱性条件下（p H>8.15）逐渐下降，在p H 6.02～8.15时，体系的荧光猝灭效果最佳。考察了缓冲溶液种类（KH2PO4-Na OH、Na2HPO4-Na H2PO4、Na H2PO4-KH2PO4、B-R、PBS、Tris-HCl、磷酸氢二钠-柠檬酸、巴比妥钠-盐酸）对体系荧光效率的影响，结果发现以p H 7.00的KH2PO4-Na OH为缓冲介质且用量为1.00 m L时，反应体系的ΔIF最大且稳定。故选择1.00 m L p H 7.00的KH2PO4-Na OH缓冲溶液为反应介质。

2.3.2 N-CDs溶液用量

考察了稀释100倍的不同体积（0.20～1.50 m L）的N-CDs对体系荧光猝灭效率的影响。当N-CDs用量为800µL时，体系ΔIF最大且稳定，随着N-CDs用量的不断增大，体系的荧光猝灭效率下降。这是因为单位体积内量子点的个数随着用量的增加而增多，但一定量的SSZ猝灭的量子点的个数是一定的，故在单位体积内N-CDs浓度越大，猝灭效率越低。最终选择800µL N-CDs溶液进行实验。

2.3.3反应时间及温度优化

考察了不同温度（20～100℃）和不同反应时间（0～520 min）下体系的ΔIF。结果表明，温度对体系ΔIF的影响不大，故选择在室温条件下进行实验。

在0～20 min反应时间内，体系ΔIF随着时间的增加而增大，20 min后体系ΔIF趋于稳定，且最少在48 h内无明显改变，实验选择20 min为反应时间。在4℃冰箱保存1个月后，N-CDs仍为透明黄棕色溶液，说明N-CDs稳定性良好。

图6不同浓度SSZ存在下N-CDs的荧光发射图

2.4柳氮磺吡啶检测

在最佳实验条件下，向N-CDs溶液中依次加入不同浓度的柳氮磺吡啶（图6），在0.1～2µmol/L和3～200µmol/L范围内，随着柳氮磺吡啶浓度的增加，体系ΔIF逐渐减小，且柳氮磺吡啶浓度（x）与荧光猝灭强度（ΔIF）呈良好线性关系，线性方程分别为ΔIF=9.405x+109.96,r2=0.994 3和ΔIF=162.59x-783.26,r2=0.997 7，检出限（3S0/S）为0.2µmol/L。本方法测定柳氮磺吡啶的线性范围优于已有文献（0.1～50µmol/L[19]和0.4～10µmol/L[20]）。

2.5 N-CDs对柳氮磺吡啶检测的选择性与抗干扰性

考察了N-CDs探针的选择性和抗干扰性，结果显示，在相对误差均≤5%范围内，1 000倍的Cd2+、Ba2+、Na+、Mg2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+,800倍的淀粉、葡萄糖、乳糖、D-果糖，500倍的SO42-、Al3+、Cl-,300倍的尼美舒利、磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶，100倍的Fe3+、Cu2+、Mn2+不产生干扰，说明N-CDs探针对柳氮磺吡啶表现出出色的选择性。

2.6实际样品分析

采用N-CDs荧光探针对柳氮磺吡啶肠溶片中的柳氮磺吡啶含量进行检测。在最佳条件下，SSZ在10、20、30µmol/L水平的加标回收率为97.3%～102%，相对标准偏差（RSD,n=3）为1.8%～3.5%。结果显示该探针可用于实际样品检测。

表1柳氮磺吡啶肠溶片中SSZ的测定结果

2.7机理分析

共振能量转移、内滤效应和光诱导电子转移、动态猝灭、静态猝灭等是荧光猝灭的主要机制[21]。如图7A所示，SSZ的紫外-可见吸收光谱有2个特征吸收峰，分别位于232 nm和356 nm，与N-CDs的激发光谱有较大重叠，推断可能是光谱内滤效应导致N-CDs的荧光猝灭。

为进一步探究荧光猝灭机理，测定了N-CDs、SSZ、N-CDs+SSZ的紫外-可见吸收光谱（图7B),N-CDs的紫外吸收峰出现在334 nm,SSZ的紫外吸收峰出现在232 nm和356 nm,N-CDs加入到SSZ中后紫外-可见吸收光谱无明显变化，推断N-CDs的荧光猝灭效应可能是静态猝灭引起的[22]。N-CDs表面大量的含氧基团可能与SSZ分子上的—OH和—COOH形成氢键，供体与受体足够接近，导致荧光发生猝灭。上述结果表明，SSZ猝灭N-CDs的机理为内滤效应和静态猝灭共同作用的结果。

图7 SSZ的紫外-可见吸收光谱、N-CDs的激发、发射光谱（A),N-CDs、SSZ和N-CDs+SSZ的紫外-可见吸收光谱图（B)

3、结论

本文以柠檬酸为碳源，没食子酸和三羟基氨基甲烷为掺杂剂，通过一步微波法制备了粒径2.91nm，荧光量子产率89.38%，稳定性好，表面含有大量羰基、羟基和羧基的水溶性N-CDs，并以其作为荧光传感器建立了检测柳氮磺吡啶的新方法。N-CDs的荧光猝灭程度与柳氮磺吡啶浓度在0.1～2µmol/L和3～200µmol/L范围呈现良好的线性关系，检出限为0.2µmol/L。本方法步骤简单、成本低、耗时短，具有较高的灵敏度和选择性，合成的掺氮碳量子点性能稳定、尺寸小，有望应用于生物样品中，还可用于细胞成像、靶向药物等医药领域，应用前景广阔。

基金资助:国家自然科学基金项目(22063010);陕西省自然科学基金项目(2022QFY07-05);延安大学校级大学生创新项目(D2023172);

文章来源:赵艳,孙雪花.掺氮碳量子点用于柳氮磺吡啶的快速检测[J].分析测试学报,2024,43(07):1052-1057.