非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)是常见的血液系统恶性肿瘤之一，以弥漫性大B细胞淋巴瘤最为常见，其生长、扩散迅速，严重威胁患者生命安全[1]。Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路参与介导癌症的发生发展，可作为白血病和淋巴瘤的治疗靶点[2],下调其表达可抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的周期进展、增殖和体内肿瘤发生，并促使其细胞凋亡[3]。红花黄色素是中药红花中的主要活性成分，具有抗癌活性，龚建明等[4]研究表明红花黄色素可抑制Wnt/β-catenin信号激活，进而诱导卵巢癌细胞凋亡，因此推测红花黄色素可能对NHL发挥抗癌作用。本研究体外培养人NHL细胞Raji, 探讨红花黄色素调节Wnt/β-catenin信号通路对NHL细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。

一、材料与方法

1 材料

动物SPF级NOD/SCID雄性小鼠，5周龄，体质量19～23 g, 由赛业(苏州)生物科技有限公司提供，动物许可证号：SCXK(苏)2020-0008。本实验经赣州市肿瘤医院动物伦理委员会批准(伦理批号：20220509)。

细胞人非霍奇金淋巴瘤细胞系Raji, 购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

药品与试剂注射用红花黄色素，规格：每瓶50 mg, 含羟基红花黄色素A 42.5 mg, 批号：20220413,浙江永宁药业股份有限公司生产；氯化锂(LiCl, Wnt/β-catenin信号通路的激活剂),纯度：≥99.98%,美国Sigma-Aldrich公司生产。PI/RNase染色缓冲液，美国BD公司生产；兔源抗人P21、Wnt1、β-actin、细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)、β-catenin、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗，均为美国Abcam公司生产；兔抗人B-淋巴细胞瘤(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine, EdU)-555细胞增殖检测试剂盒，均为上海碧云天生物技术有限公司生产。

仪器cytation 5多功能酶标仪，美国Bio Tek公司产品；DxP Athena流式细胞仪，青岛佳鼎分析仪器有限公司产品；NIB-100F倒置荧光显微镜，济南欧莱博技术有限公司产品；1658033小型蛋白电泳转印系统，美国Bio-Rad公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养[5]5]

取出冻存人NHL细胞系Raji快速放入39.5 ℃温水浴中解冻后，以RPMI-1640完全培养基(RPMI-1640基础培养基+10%胎牛血清+1%双抗)复苏培养至约80%细胞融合，进行传代。

2.2 筛选红花黄色素处理的Raji细胞存活率最佳作用浓度[6]6]

细胞接种在96孔培养板中，每孔约接种1×104个细胞，培养36 h后分别以终浓度0、5、10、20、30和40 μg·mL-1的红花黄色素处理，24 h后每孔加入适量噻唑蓝工作液孵育4 h, 参照噻唑蓝试剂盒说明书中指导步骤检测各组细胞光密度值，计算公式为：存活率=(光密度值药物处理组-光密度值空白对照组)/(光密度值对照组-光密度值空白对照组)×100%。

2.3 实验分组与处理方法

细胞实验取24孔培养板于其中接种传代后的细胞，每孔约接种1×105个细胞，培养36 h后随机分为对照组、红花黄色素组、LiCl组、红花黄色素+ LiCl组，对照组细胞不做处理，红花黄色素组细胞以终浓度30 μg·mL-1的红花黄色素处理，LiCl组细胞以终浓度20 mmol·L-1的LiCl处理[7],红花黄色素+ LiCl组细胞以终浓度30 μg·mL-1的红花黄色素和终浓度20 mmol·L-1的LiCl联合处理，24 h后收集各组细胞沉淀存在-80 ℃备用。

动物实验参考文献[9]构建NHL移植瘤小鼠模型，成功构建NHL移植瘤的小鼠，随机分为对照组、红花黄色素组、LiCl组、红花黄色素+ LiCl组，红花黄色素组小鼠尾静脉注射7.5 mg·kg-1红花黄色素(每隔1 d注射1次，1.5 mg·mL-1红花黄色素0.9%NaCl溶液5 mL·kg-1)[6],同时灌胃5 mL·kg-1 0.9%NaCl(每天1次);LiCl组小鼠灌胃1 mg·mL-1的LiCl(每天1次，0.1 mg·mL-1的LiCl 0.9% NaCl溶液5 mL·kg-1)[10],同时尾静脉注射5 mL·kg-1 0.9%NaCl(每隔1 d注射1次);红花黄色素+ LiCl组小鼠尾静脉注射7.5 mg·kg-1红花黄色素(每隔1d注射1次，1.5 mg·mL-1红花黄色素0.9%NaCl溶液5 mL·kg-1),同时灌胃1 mg·kg-1的LiCl(每天1次，0.1 mg·mL-1的LiCl 0.9% NaCl溶液5 mL·kg-1);对照组小鼠尾静脉注射5 mL·kg-1 0.9%NaCl(每隔1 d注射1次),同时灌胃5 mL·kg-1 0.9%NaCl(每天1次)。

2.4 蛋白质印迹法检测各组细胞Wnt/β-catenin信号通路、凋亡及细胞周期相关蛋白的表达水平[8]8]

以RIPA缓冲液提取“2.3”中采集的各组细胞中总蛋白，用BCA法测出其浓度后以100 ℃沸水浴煮沸5 min变性，每组取出蛋白15 μg于120 V恒压下电泳80 min, 然后于40 mA稳定电流下湿转75 min, 最终于硝酸纤维素膜上得到分离的蛋白，将蛋白剪下后进行封闭处理后，分别孵育相对应一抗及二抗后显色，采集各组蛋白图像后以Image J软件定量其灰度值，最终进行统计分析得到各组蛋白相对表达水平。

2.5 乙酰脱氧尿苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine, EdU)法检测各组细胞的增殖情况[5]5]

取24孔培养板于其中接种传代后的Raji细胞，每孔约接种1×105个细胞，培养36 h后按照“2.3”中步骤分组处理24 h, 然后加入Edu试剂孵育1.5 h, 然后洗涤、固定细胞后按照EdU-555细胞增殖检测试剂盒说明书指导进行Edu染色，用荧光显微镜采集各组细胞图像后以Image J软件定量各组Edu阳性细胞数及总细胞数，然后计算各组细胞增殖率，公式：增殖率=Edu阳性细胞数/总细胞数×100%。

2.6 流式细胞实验检测各组细胞周期分布和凋亡[5]5]

取24孔培养板于其中接种传代后的Raji细胞，每孔约接种1×105个细胞，培养36 h后按照“2.3”中步骤分组处理24 h, 然后收集各组细胞，以磷酸盐缓冲液洗涤并重悬后计数，每组取5×105个细胞，平分为2份，一份进行PI/RNase染色(按PI/RNase 染色缓冲液说明书指导操作),一份进行FITC/PI双染(按照Annexin V 凋亡检测试剂盒说明书指导操作),分别洗涤后采集流式细胞仪检测各组细胞周期分布及凋亡率。

2.7 各组小鼠肿瘤体积与质量测量[9]9]

各组移植瘤小鼠均处理3周后颈椎脱臼处死小鼠，剪开右前腋皮肤剥离出肿瘤组织，测量质量、最长径(记为a)及最短径(记为b),计算其体积，公式为：肿瘤体积=1/2×a×b2。

3 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料用表示。比较多组间差异进行单因素方差分析，两两间差异进一步比较进行SNK-q检验。

二、结果

1 红花黄色素对人NHL细胞Raji存活率的影响

0、5、10、20、30和40 μg·mL-1的红花黄色素处理后Raji细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(88.26±11.58)%、(77.41±10.63)%、(63.02±9.24)%、(48.97±8.15)%和(38.01±7.47)%;与0 μg·mL-1比较，5、10、20、30和40 μg·mL-1的红花黄色素均可降低Raji细胞存活率(均P<0.05),且随着红花黄色素浓度升高其降低作用增强，本研究选择最接近IC50值的红花黄色素浓度30 μg·mL-1进行后续实验。

2 红花黄色素对Raji细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响

体外培养Raji细胞，随机分为对照组、红花黄色素组(30 μg·mL-1红花黄色素)、氯化锂组(20 mmol·L-1 LiCl)、红花黄色素+LiCl组(30 μg·mL-1红花黄色素+20 mmol·L-1 LiCl)。

对照组、红花黄色素组、LiCl组、红花黄色素+LiCl组的Wnt1蛋白相对表达水平分别为0.64±0.11、0.19±0.04、1.07±0.40、0.59±0.07,β-catenin蛋白相对表达水平分别为0.71±0.15、0.14±0.03、1.28±0.22、0.66±0.12。与对照组相比，红花黄色素组细胞Wnt1、β-catenin蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05);LiCl组细胞Wnt1、β-catenin蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05);与红花黄色素组相比，红花黄色素+LiCl组细胞Wnt1、β-catenin蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05)。

3 红花黄色素对Raji细胞增殖、凋亡的影响

对照组、红花黄色素组、LiCl组、红花黄色素+LiCl组的细胞增殖率分别为(36.78±5.45)%、(7.86±1.32)%、(54.65±6.73)%、(33.29±4.90)%,细胞凋亡率分别为(5.13±0.67)%、(57.68±7.31)%、(0.91±0.29)%、(7.24±1.40)%。与对照组相比，红花黄色素组细胞凋亡率显著升高，增殖率显著降低(均P<0.05);LiCl组细胞凋亡率显著降低，增殖率显著升高(P<0.05);与红花黄色素组相比，红花黄色素+LiCl组细胞凋亡率显著降低，增殖率显著升高(均P<0.05),见图1。

4 红花黄色素对Raji细胞周期的影响

对照组、红花黄色素组、LiCl组、红花黄色素+LiCl组的G0/G1期细胞比例分别为(43.79±5.32)%、(75.10±8.12)%、(27.63±3.40)%、(46.35±4.84)%,S期细胞比例分别为(52.14±6.45)%、(21.25±2.83)%、(62.89±7.28)%、(49.71±5.46)%。与对照组相比，红花黄色素组的G0/G1期细胞比例显著升高(P<0.05),S期细胞比例显著降低(P<0.05);LiCl组的G0/G1期细胞比例显著降低(P<0.05),S期细胞比例显著升高(P<0.05);与红花黄色素组相比，红花黄色素+LiCl组的G0/G1期细胞比例显著降低(P<0.05),S期细胞比例显著升高(P<0.05)。

5 红花黄色素对Raji细胞凋亡及细胞周期相关蛋白表达的影响

对照组、红花黄色素组、LiCl组、红花黄色素+LiCl组的Bax蛋白相对表达水平分别为0.47±0.08、0.91±0.19、0.09±0.02、0.51±0.10,Bcl-2蛋白表达水平分别为0.53±0.09、0.09±0.02、0.99±0.14、0.49±0.07,P21蛋白相对表达水平分别为0.56±0.12、1.08±0.20、0.13±0.04、0.59±0.11,Cyclin D1蛋白相对表达水平分别为0.60±0.13、0.11±0.02、1.09±0.17、0.56±0.06,Cyclin E1蛋白相对表达水平分别为0.64±0.14、0.16±0.04、1.15±0.25、0.60±0.08。与对照组相比，红花黄色素组细胞Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E1蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05),Bax、P21蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05);LiCl组细胞Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E1蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05),Bax、P21蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05)。与红花黄色素组相比，红花黄色素+LiCl组Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E1蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05),Bax、P21蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05)。

图1 5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)染色检测各组Raji细胞增殖率(×200)   

6 红花黄色素对Raji移植瘤裸鼠肿瘤质量和体积的影响

裸鼠右前腋皮下接种Raji细胞构建NHL移植瘤模型，随机分为Nu-对照组、Nu-红花黄色素(7.5 mg·kg-1)组、Nu-LiCl(1 mg·kg-1)组、Nu-红花黄色素(7.5 mg·kg-1)+ LiCl(1 mg·kg-1)组。

Nu-对照组、Nu-红花黄色素组、Nu-LiCl组、Nu-红花黄色素+LiCl组的肿瘤体积分别为(915.34±61.43)、(578.46±42.54)、(1 310.84±93.16)和(878.75±56.20)mm3,肿瘤质量分别为(0.86±0.13)、(0.45±0.09)、(1.31±0.15)和(0.75±0.17)g。与Nu-对照组相比，Nu-红花黄色素组裸鼠肿瘤质量和体积均显著降低(均P<0.05);Nu-LiCl组裸鼠肿瘤质量和体积均显著升高(均P<0.05);与Nu-红花黄色素组相比，Nu-红花黄色素+LiCl组裸鼠肿瘤质量和体积均显著升高(均P<0.05)。

三、讨论

Wnt/β-catenin是调控癌细胞生长、凋亡、上皮间质转化、侵袭及转移的重要信号通路，在血液系统肿瘤发生发展中发挥关键作用，抑制其激活可诱导细胞周期停滞，抑制T细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞增殖[11],还可抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞增殖、侵袭、迁移及细胞周期进展并促进其凋亡[12,13]。本研究结果显示，以红花黄色素处理Raji细胞可降低其Wnt1及β-catenin蛋白表达，而以Wnt信号激活剂LiCl处理Raji细胞可促进其细胞周期进展、增殖及移植瘤小鼠体内生长，抑制其细胞凋亡，表明Wnt/β-catenin信号参与介导NHL的发生发展及红花黄色素对NHL细胞增殖和细胞周期的抑制过程；以红花黄色素和LiCl联合处理Raji细胞，相比红花黄色素单独处理，可升高细胞增殖率、S期细胞比例、裸鼠肿瘤质量和体积、Wnt1及β-catenin、Bcl-2、Cyclin D1、Cyclin E1蛋白表达，降低其凋亡率、G0/G1期细胞比例、Bax及P21蛋白表达，表明激活Wnt信号可减弱红花黄色素对NHL细胞周期进展、增殖及移植瘤小鼠体内生长的抑制作用，消除其对NHL细胞凋亡的促进作用，最终逆转红花黄色素对NHL的抗癌功效，揭示红花黄色素抑制NHL细胞增殖和细胞周期并促进其凋亡是通过抑制Wnt信号实现的。

本研究提示，红花黄色素可降低Wnt1及β-catenin蛋白表达，从而诱导细胞周期停滞，抑制NHL细胞增殖及在移植瘤小鼠体内生长，并增强其凋亡，最终起到显著抗癌功效。

参考文献:

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文章来源:易琰斐,许美瑾,王琪.红花黄色素对非霍奇金淋巴瘤的作用与机制[J].中国临床药理学杂志,2024,40(06):839-843.