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瑞马唑仑减轻心肌缺血/再灌注大鼠心肌损伤

2024-09-03 72 上传者：管理员

摘要：目的探究瑞马唑仑(RE)对心肌缺血/再灌注(MI/R)大鼠心肌损伤的影响，并探讨其可能机制。方法将大鼠分为假手术组、MI/R模型组、RE低、中、高剂量组(RE-L、M、H组)、Yes相关蛋白(YAP)抑制剂维替泊芬(verteporfin)组。检测各组大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS);试剂盒测定乳酸脱氢酶(LDH)、肌钙蛋白(c-TnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平；TTC染色评估心肌梗死面积，HE染色观察心肌组织病理改变；TUNEL法测定心肌细胞凋亡；Western blot分析心肌组织Hippo/YAP信号通路蛋白表达。结果相较于假手术组，模型组大鼠心肌结构破坏，心肌细胞减少，LVFS、LVEF降低，YAP表达显著降低，血清LDH、CK-MB、cTnI水平、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率、p-MST1/MST1、p-LATS1/LATS1、p-YAP表达显著升高(P<0.05);与模型组相比，RE低、中、高剂量组大鼠心肌组织病理改变均明显减轻，LVFS、LVEF升高，YAP表达显著升高，血清LDH、CK-MB、cTnI水平、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率、p-MST1/MST1、p-LATS1/LATS1、p-YAP表达显著降低(P<0.05);YAP抑制剂verteporfin组逆转RE对MI/R大鼠心肌损伤的改善。结论 RE可能通过调节Hippo/YAP信号通路改善MI/R大鼠心功能，减少心肌梗死和心肌细胞凋亡，改善心肌损伤。

关键词：
Hippo/Yes相关蛋白
RE
心肌损伤
心肌缺血/再灌注
瑞马唑仑
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缺血性心脏病是世界范围内的主要死亡原因之一，具有较高的发病率和病死率[1]。血运重建术是及时有效地恢复心肌细胞的有效治疗方法，但冠状动脉闭塞和血流突然恢复可导致更严重的心肌细胞损伤，即心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia-reperfusion injury, MI/R)损伤[2]。因此，寻找治疗MI/R损伤的药物迫在眉睫。瑞马唑仑(remimazolam, RE)可在提供快速麻醉和苏醒的同时稳定血流动力学，对呼吸的抑制作用较小[3]。研究发现，RE具有显著的抗MI/R损伤活性，能减少心肌梗死，增强心脏功能[4]。Hippo通路是三步级联的丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路，由哺乳动物STE20样蛋白激酶1/2(mammalian sterile 20-like kinase 1/2,MST1/2)、大肿瘤抑制因子1/2(large tumor suppres-sor gene 1/2,LATS1/2)和Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)组成[5]。Hippo通路通过磷酸化和失活下游效应分子YAP,参与调控细胞的增殖、分化和凋亡。研究表明，Hippo/YAP信号通路失活发挥对MI/R损伤后心脏功能的调节至关重要，对MI/R损伤发挥保护作用[6]。但RE对MI/R损伤发挥保护作用的具体机制还需探讨。因此，通过构建MI/R损伤大鼠模型，观察RE对MI/R损伤大鼠的保护作用，并发现其与Hippo/YAP信号通路的关系。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：

Sprague-Dawley大鼠，雄性，体质量200～220 g, SPF级[广东至远生物医药科技有限公司(SCXK(粤)2021-0057],饲养环境维持在20 ℃～25 ℃,湿度40%～50%,标准光照-黑暗循环。所有实验过程均按照动物管理和使用委员会制定的指导原则进行。

1.1.2 主要试剂：

注射用苯磺酸RE(江苏恒瑞医药股份公司);YAP抑制剂(维替泊芬verteporfin, 北京百奥莱博科技公司);苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(江西江蓝纯生物试剂公司);原位末端标记法(TUNEL)试剂盒(杭州铂赛生物科技公司);TTC染色液、二抗(上海源叶生物科技公司);乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)试剂盒(上海佰利莱生物公司);肌钙蛋白(cardiac troponin I,cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme, CK-MB)试剂盒(上海康朗生物公司);一抗MST1、p-MST1、LATS1、p-LATS1、p-YAP、YAP和β-actin(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组和药物干预：

将大鼠分为假手术组、MI/R模型组(参照文献[7]建模：缺血30 min, 再灌注120 min)、RE低、中和高剂量组(RE-L、M、H组，分别尾静脉注射5、10和20 mg/kg)干预模型组、YAP抑制剂(尾静脉注射20 mg/kg verteporfin)联合RE-H(尾静脉注射20 mg/kg RE)干预模型组(verteporfin组),每组15只。假手术组和模型组给予相同剂量的0.9%氯化钠溶液。再灌注后24 h麻醉处死大鼠，取心肌组织用于后续实验。

1.2.2 超声检测心功能：

MI/R造模完成后，各组大鼠处死前，采用超声成像系统检测左心室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)。

1.2.3 心肌损伤标志物的测定：

取各组大鼠主动脉血2 mL,分离血清，根据试剂盒说明书的方法分别测量CK-MB、LDH、c-TnI水平。

1.2.4 心肌梗死面积的评估：

各组随机取5只大鼠，麻醉处死取心肌组织，在液氮中冷冻约20 min, 切成厚度约1 mm的切片，置于浓度为2%的TTC中，37 ℃避光染色20 min。后将切片放入4%多聚甲醛中固定24 h, 并拍照。分析图像，计算心肌梗死面积。

1.2.5 HE染色观察心肌病理改变：

随机取5只大鼠，麻醉处死，分离心肌组织，将其固定在多聚甲醛中，然后制成成4 μm的石蜡切片，HE染色后进行脱水、封片，最后在显微镜下观察。

1.2.6 TUNEL观察心肌细胞凋亡：

取1.3.5中石蜡切片，切片用二甲苯I/II和乙醇梯度处理，用蛋白酶K溶液在37 ℃下孵育30 min, 后在TUNEL染色液暗孵育60 min, 苏木精反染色60 s, 密封心肌组织切片，并在显微镜下拍照。

1.2.7 Western blot检测蛋白质表达：

取各组剩余5只大鼠心肌组织，用裂解缓冲液匀浆，测定蛋白质浓度，通过电泳分离目标蛋白质，将其转移到PVDF膜上，与一抗p-MST1、MST1、p-LATS1、LATS1、p-YAP、YAP和β-actin孵育过夜，然后与二抗孵育，最后进行图像显影。最后，对各波段的吸光度值进行分析。

1.3 统计学分析

计量资料以均值±标准差

表示，用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，多组间比较用单因素方差分析和SNK-q检验。

2、结果

2.1 RE对大鼠心功能的影响

表1显示，相比于假手术组，模型组LVFS、LVEF降低(P<0.05);相比于模型组，RE-L、M、H组LVFS、LVEF升高(P<0.05);相比于RE-H组，verteporfin组LVFS、LVEF降低(P<0.05)。

2.2 RE对心肌损伤标志物的影响

相比于假手术组，模型组LDH、CK-MB、cTnI升高(P<0.05);相比于模型组，RE-L、M、H组LDH、CK-MB、cTnI降低(P<0.05);相比于RE-H组，verteporfin组LDH、CK-MB、cTnI升高(P<0.05)(表2)。

表1 各组大鼠心功能指标变化比较

表2 各组大鼠血清LDH、CK-MB、cTnI水平比较

图1 TTC染色检测心肌梗死

2.3 RE对心肌梗死面积的影响

相比于假手术组，模型组梗死面积升高(P<0.05);相比于模型组，RE-L、M、H组梗死面积降低(P<0.05);相比于RE-H组，verteporfin组梗死面积升高(P<0.05)(图1,表3)。

表3 各组大鼠心肌梗死面积比较

2.4 RE对心肌病理改变的影响

假手术组大鼠心肌组织结构正常，间质光滑，心肌细胞形态完整，排列整齐；模型组大鼠心肌结构破坏，间质水肿，心肌细胞排列紊乱；RE-L、M、H组大鼠的心肌组织病理改变均明显减轻，心肌结构排列整齐，有轻度肿胀；Verteporfin组心肌组织病理损伤加重(图2)。

2.5 RE对心肌细胞凋亡的影响

相比于假手术组，模型组大鼠心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.05);相比于模型组，RE-L、M、H组大鼠心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05);相比于RE-H组，verteporfin组凋亡率升高(P<0.05)(图3,表4)。

2.6 RE对大鼠Hippo/YAP信号通路相关蛋白表达的影响

相比于假手术组，模型组心肌组织p-MST1/MST1、p-LATS1/LATS1、p-YAP表达显著升高，YAP表达显著降低(P<0.05);相比于模型组，ERI-L、M、H组p-MST1/MST1、p-LATS1/LATS1、p-YAP表达显著降低，YAP显著升高(P<0.05);相比于ERI-H组，verteporfin组p-MST1/MST1、p-LATS1/LATS1、p-YAP表达显著升高，YAP显著降低(P<0.05)(图4)。

图2 各组大鼠心肌组织病理变化结果

图3 各组大鼠心肌细胞凋亡结果

表4 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较

图4 各组大鼠心肌Hippo/YAP信号通路蛋白表达

3、讨论

冠脉血流恢复是减少心肌缺血损伤、提高生存率的最有效干预措施。但再灌注过程中造成的MI/R损伤，进而诱导心力衰竭、再灌注性心律失常、心源性猝死等症状的发生[8]。因此，保证缺血心肌组织的血供恢复是预防或减轻MI/R损伤的重要目标。本研究数据显示，模型大鼠心肌结构破坏，心功能下降，大面积心肌梗死面积，且心肌损伤标志物CK-MB、LDH、cTnI显著升高，提示MI/R模型构建成功。心肌细胞凋亡是MI/R损伤的重要机制，在心肌再灌注条件下，缺血时心肌细胞氧自由基生成的增加和钙离子的过载会启动心肌细胞的程序性凋亡[9-10]。本研究显示，MI/R模型大鼠心肌细胞凋亡率显著升高，提示MI/R损伤引发心肌细胞凋亡。

RE已被证实对细胞损伤具有一定的修复作用，还能通过靶向METTL3减轻缺氧/氧再灌处理的人胚肝细胞株的损伤[11]。此外，RE有效改善脑 I/R损伤和MI/R损伤[4,12]。因此，RE可能是改善I/R损伤的有效药物。经RE治疗后，模型大鼠心肌组织病理改变均明显减轻，心功能改善，心肌损伤标志物、心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率显著降低，提示RE能通过改善MI/R大鼠心功能，减少心肌梗死，降低心肌细胞凋亡，发挥对MI/R损伤的保护作用。

Hippo/YAP信号通路在心血管发育、心肌细胞再生和自噬等各种生物过程中起着至关重要的作用[5]。当Hippo通路被激活时，MST1/2、LATS1/2被磷酸化激活，进而磷酸化YAP,引起其细胞质滞留和功能失活；而Hippo信号抑制时，非磷酸化的YAP在细胞核中积累，参与各种细胞过程[13]。研究表明，Hippo/YAP信号的失调参与MI/R损伤的发展，抑制Hippo通路，调节转录调节因子YAP的核易位可改善MI/R诱导的坏死性凋亡[14]。此外，过表达YAP可减少心肌梗死面积，改善心功能[15]。本研究发现，MI/R模型大鼠心肌组织p-MST1/MST1、p-LATS1/LATS1、p-YAP表达显著升高，YAP表达显著降低，提示Hippo/YAP信号通路在MI/R损伤中发挥重要作用。经RE治疗后，大鼠心肌组织p-MST1/MST1、p-LATS1/LATS1、p-YAP表达显著降低，YAP表达显著升高，提示RE对MI/R损伤的作用可能与Hippo/YAP通路有关。而YAP抑制剂verteporfin可逆转RE对MI/R损伤的保护作用，证实RE通过调节Hippo/YAP信号通路参与MI/R损伤的进展。

综上所述，RE可能通过调节Hippo/YAP信号通路改善MI/R大鼠心功能，减少心肌梗死和心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用。本研究为MI/R损伤的保护提供新见解，但RE对改善MI/R损伤的其他作用机制仍需进一步探究。

参考文献:

[7]陈兴华,韩露,贡鸣,等.落新妇苷对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及机制[J].中国药房,2023,34:1193-1198,1203.

[9]郑新,于海波.miR-146a减轻心肌缺血/再灌注损伤(MI/RI)大鼠的心肌细胞凋亡[J].基础医学与临床,2021,41:1756-1761.

基金资助:保定市科技计划项目(2041ZF206);

文章来源:甄磊,张懿兰,王晓娜,等.瑞马唑仑减轻心肌缺血/再灌注大鼠心肌损伤[J].基础医学与临床,2024,44(09):1243-1248.