缺血性心脏病是世界范围内主要的死亡原因之一[1]。通过冠状动脉再灌注可以提高患者的生存率。然而,再灌注本身也有可能引起致命的心肌损伤,这一过程被称为心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤[2]。心肌I/R损伤是急性心肌梗死、心脏骤停、经皮冠状动脉介入治疗和心脏外科手术等重要临床场景中发病和死亡的主要原因[3,4]。因此,需要阐明心肌I/R损伤的潜在机制,以开发有效的治疗方法。既往研究表明,左旋卡尼汀(L-carritine)对缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)诱导的乳鼠心肌细胞具有保护作用,可以降低H/R诱导的心肌细胞凋亡率[5]。在缺血、缺氧刺激的心肌细胞中,左旋卡尼汀能够减轻细胞凋亡,保护心肌细胞免受缺血、缺氧损伤[6]。左旋卡尼汀还可以降低I/R引起的心肌细胞凋亡[7]。CT10激酶调节子样蛋白(CT10regulatorofkinaselikeprotein,CrkL)过表达时可抑制H/R导致的心肌细胞凋亡,增加细胞存活率[8]。CrkL在H/R刺激的H9c2细胞中低表达,过表达CrkL可抑制正常培养的H9c2心肌细胞凋亡,促进细胞存活,且显著抑制H/R诱导的H9c2心肌细胞凋亡增加、存活力降低[8,9]。然而左旋卡尼汀、CrkL对H/R损伤H9c2细胞炎症因子分泌的影响,以及二者联用在心肌I/R损伤中的功能尚不清楚。鉴于此,本研究旨在考察左旋卡尼汀联合CrkL对H/R诱导的心肌细胞增殖、凋亡和炎症的影响,为心肌I/R损伤的治疗选择提供新的线索。

1、材料和方法

1.1细胞与试剂

H9c2细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),DMEM培养基购自美国Sigma-Aldrich公司,细胞计数试剂盒8(cellcountingkit-8,CCK-8)购自日本Dojindo公司,AnnexinV-PI凋亡试剂盒购自美国Invitrogen公司,细胞核相关抗原Ki-67(nuclearassociatedantigenKi67,Ki-67)、增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)、B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcelllymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associatedXprotein,Bax)、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、核因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)、CrkL、辣根过氧化物酶偶联的二抗购自英国Abcam公司。

1.2细胞培养、转染与实验分组

H9c2细胞在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养基中,在5%CO2培养箱中于37℃孵育。细胞生长至70%～80%汇合,将H9c2细胞置于5%CO2、94%N2和1%O2的潮湿环境中缺氧4h,再复氧12h,建立H/R损伤模型[10]。为了确定左旋卡尼汀或CrkL对H/R诱导的心肌细胞损伤的作用,将细胞分为:对照(Control)组:正常培养的H9c2细胞;模型(H/R)组:H/R处理H9c2细胞;H/R+左旋卡尼汀(1μmol/L)组:H/R和1μmol/L左旋卡尼汀处理H9c2细胞;H/R+左旋卡尼汀(2μmol/L)组:H/R和2μmol/L左旋卡尼汀处理H9c2细胞;H/R+左旋卡尼汀(5μmol/L)组:H/R和5μmol/L左旋卡尼汀处理H9c2细胞。以2μmol/L的左旋卡尼汀进行后续实验。H/R+pcDNA-NC组:转染pcDNA-NC和进行H/R处理;H/R+CrkL组:转染pcDNA-CrkL和进行H/R处理;H/R+左旋卡尼汀+CrkL组:转染pcDNA-CrkL,进行H/R和2μmol/L左旋卡尼汀处理。其中,左旋卡尼汀预处理24h后进行H/R处理。细胞转染时,根据Lipofectamine2000试剂说明书的指示,将pcDNA-NC、pcDNA-CrkL转染到生长至70%汇合的H9c2细胞,转染24h后进行其他处理。

1.3CCK-8检测细胞增殖

将H9c2细胞接种到96孔板(3×105个/孔)中,并在37℃和5%CO2下孵育48h。随后,将CCK-8试剂添加到每孔中,并将心肌细胞继续培养4h。使用酶标仪检测450nm处的吸光度(A)值。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡

将H9c2细胞以1×106个/孔接种在6孔板中,经过不同处理后,用冰冷的PBS洗涤2次,细胞轻轻重悬于500μLAnnexinV结合缓冲液中。然后5μLAnnexinV-FITC和5μLPI添加到每组细胞中,轻轻摇动。在室温下孵育10min后,使用FACScan流式细胞仪在488nm的激发波长和530nm的发射波长下分析细胞凋亡。

1.5Westernblot检测Ki-67、PCNA、Bcl-2、Bax、TNF-α、IL-1β、NF-κB、CrkL水平

收获不同处理的H9c2细胞,在加入蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀缓冲液中裂解。4℃下12000g离心10min,使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白水平。之后用10%～12%SDS-PAGE分离等量的蛋白(50μg),然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%的脱脂牛奶封闭2h,将膜与抗Ki-67、PCNA、Bcl-2、Bax、TNF-α、IL-1β、NF-κB、CrkL(1∶1000)和β-actin(1∶2000)抗体在4℃下过夜。孵育后,将膜用TBST洗涤3次,然后用辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶5000)在室温下放置2h。使用增强的化学发光试剂将膜可视化,使用ImageJ软件对结果进行定量。β-actin用作内对照。

1.6统计学分析

数据采用SPSS22.0软件进行统计处理,结果以x¯±s表示,两组间数据的比较采用t检验,多组数据间的比较采用单因素方差分析,组间多重比较使用SNK-q检验,P<0.05认为差异有显著性。

2、结果

2.1左旋卡尼汀处理对缺氧复氧诱导的H9c2细胞增殖和凋亡的影响

CCK-8、流式细胞术、Westernblot检测结果显示,与对照组比较,H/R组H9c2细胞的活力明显降低,细胞凋亡率显著增加,Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达量明显减少,Bax蛋白水平显著升高;与H/R组比较,左旋卡尼汀明显增加H/R诱导的H9c2细胞活力,显著减少细胞凋亡率,以及提高Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达水平,降低Bax蛋白水平(P<0.05,图1和图2)。

图1.不同浓度左旋卡尼汀对H/R诱导的H9c2细胞增殖与凋亡的影响

图2.左旋卡尼汀处理对H/R诱导的H9c2细胞增殖和凋亡相关蛋白表达水平的影响

2.2左旋卡尼汀处理对H/R诱导的H9c2细胞炎症因子表达的影响

Westernblot检测结果表明,与对照组比较,H/R组H9c2细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、NF-κB的水平明显提高;与H/R组比较,左旋卡尼汀显著降低H/R诱导的H9c2细胞中TNF-α、IL-1β和NF-κB表达水平(P<0.05,图3)。

2.3左旋卡尼汀处理促进H/R诱导的H9c2细胞CrkL的表达

Westernblot检测结果显示,与对照组比较,H/R组H9c2细胞内CrkL蛋白表达量明显减少;与H/R组比较,左旋卡尼汀显著提高H/R诱导的H9c2细胞中CrkL蛋白水平(P<0.05,图4)。

图3.左旋卡尼汀处理对H/R诱导的H9c2细胞炎症因子表达的影响

图4.左旋卡尼汀处理对H/R诱导的H9c2细胞CrkL表达的影响

2.4CrkL过表达对H/R诱导的H9c2细胞增殖和凋亡的影响

CCK-8、流式细胞术、Westernblot检测结果表明,与对照组比较,H/R组H9c2细胞的活力明显降低,细胞凋亡率显著增加,且Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白水平明显降低,Bax蛋白表达量显著升高;与H/R组比较,CrkL过表达明显增加H/R诱导的H9c2细胞活力,显著降低细胞凋亡率,并提高Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白水平,减少Bax蛋白表达量(P<0.05,图5和图6)。

图5.CrkL过表达对H/R诱导的H9c2细胞增殖和凋亡的影响

图6.CrkL过表达对H/R诱导的H9c2细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

2.5CrkL过表达对H/R诱导的H9c2细胞炎症因子表达的影响

Westernblot检测结果发现,与对照组比较,H/R组H9c2细胞的TNF-α、IL-1β、NF-κB表达明显增加;与H/R组比较,CrkL过表达明显减少H/R诱导的H9c2细胞中TNF-α、IL-1β、NF-κB表达(P<0.05,图7)。

图7.CrkL过表达对H/R诱导的H9c2细胞炎症因子表达的影响

2.6左旋卡尼汀联合CrkL过表达对H/R诱导的H9c2细胞增殖、凋亡和炎症因子表达的影响

CCK-8、流式细胞术、Westernblot检测结果显示,与对照组比较,H/R组H9c2细胞的活力、Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达量明显减少,细胞凋亡率、Bax蛋白水平及TNF-α、IL-1β、NF-κB水平显著升高;与H/R组比较,左旋卡尼汀或CrkL过表达明显增加H/R诱导的H9c2细胞活力和Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达量,显著降低细胞凋亡率、Bax蛋白水平及TNF-α、IL-1β、NF-κB水平;与H/R+左旋卡尼汀组或H/R+CrkL组比较,H/R+左旋卡尼汀+CrkL组H9c2细胞的活力、Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达量明显升高,细胞凋亡率、Bax蛋白水平及TNF-α、IL-1β、NF-κB水平显著降低(P<0.05,图8、图9和图10)。

图8.左旋卡尼汀联合CrkL过表达对H/R诱导的H9c2细胞增殖和凋亡的影响

图9.左旋卡尼汀联合CrkL过表达对H/R诱导的H9c2细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

图10.左旋卡尼汀联合CrkL过表达对H/R诱导的H9c2细胞炎症因子表达的影响

3、讨论

目前,心肌I/R损伤的分子机制尚未明确。本研究中,通过用H/R刺激H9c2细胞建立了I/R细胞模型,以评估左旋卡尼汀和CrkL在心肌I/R损伤中的潜在作用。值得注意的是,左旋卡尼汀或过表达CrkL可保护H9c2细胞免受H/R诱导的细胞损伤和减轻炎症反应,并且左旋卡尼汀与过表达CrkL联合的保护效果显著优于二者单独使用。

H/R会抑制H9c2细胞的增殖,表现为细胞活力降低[11],细胞增殖相关蛋白Ki-67、PCNA被下调;并且,H9c2细胞发生凋亡[12],伴随着抗凋亡蛋白Bcl-2的下调和促凋亡蛋白Bax的上调。此外,H9c2细胞在H/R处理后产生炎症反应[13],炎症因子TNF-α、IL-1β、NF-κB表达增加。越来越多的文献报道了左旋卡尼汀在心肌细胞损伤中的保护作用[14],左旋卡尼汀有助于长链脂肪酸转运到线粒体基质中,通过减少氧化应激、心肌细胞的炎症和坏死而触发心脏保护作用[15]。左旋卡尼汀预处理在I/R后可显著改善心脏功能,抑制心肌细胞凋亡,降低Bax表达水平,增加Bcl-2蛋白表达,其对心肌缺血损伤的心脏保护作用可能与PI3K/Akt信号通路有关[16]。左旋卡尼汀可以保护心肌细胞免受氧化应激相关的损害,防止活性氧形成并在高血糖情况下激活抗氧化信号通路[17]。本研究提供了新的体外证据,发现左旋卡尼汀可能对H/R诱导的心肌细胞损伤具有保护作用,能够促进细胞增殖,并抑制凋亡,与前人研究[5,6,7]一致。此外,左旋卡尼汀对H/R诱导的H9c2细胞炎症因子表达具有抑制作用,提示左旋卡尼汀发挥保护心肌免受I/R损伤的作用可能是通过促进细胞增殖、减轻凋亡和炎症反应来实现的。

CrkL基因是喉鳞状细胞癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌等多种人类肿瘤的重要调节因子,参与细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学过程[18,19,20,21]。过表达CrkL保护心肌免受I/R损伤的作用已有报道[8,9]。microRNA-429(miR-429)的下调可以通过促进CrkL的表达并抑制MEK/ERK信号通路的激活,减轻氧化应激、炎症反应和心肌细胞凋亡,而对冠心病大鼠的心肌损伤产生保护作用[22]。在H/R诱导H9c2心肌细胞损伤中,敲低CrkL可以增加细胞凋亡并抑制细胞增殖和存活;相比之下,CrkL的过表达可以通过调节Bax和细胞外信号调节激酶1/2的磷酸化改善H9c2心肌细胞损伤[23]。本实验中,同样发现过表达CrkL促进H/R诱导的H9c2细胞增殖和抑制细胞凋亡,与前述报道相符。同时,过表达CrkL对H/R引起的H9c2细胞炎症反应显示出一定的抑制作用,即抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、NF-κB的表达。而相比于单独使用左旋卡尼汀或CrkL过表达,左旋卡尼汀联合CrkL过表达明显提高H9c2细胞的活力和Ki-67、PCNA、Bcl-2蛋白表达量,显著降低细胞凋亡率、Bax蛋白水平及TNF-α、IL-1β、NF-κB水平。

总之,本研究表明,左旋卡尼汀或过表达CrkL可以促进H/R诱导的H9c2细胞增殖,抑制细胞凋亡,并减轻炎症反应,以保护H9c2细胞免受H/R诱导的细胞损伤,二者联合应用效果更显著。这些发现可能有助于左旋卡尼汀在心血管疾病中的临床应用。

参考文献：

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基金:湖北省卫生健康委重点支持项目(WJ2019H139)