开心散为《古代经典名方目录(第一批)》收载的第33首经典名方[1],始载于《备急千金要方》[2],由人参、远志、茯苓、石菖蒲4味药组成。开心散常用于增强记忆力、缓解焦虑、治疗抑郁。其主要成分包括糖脂类成分[3,4]、茯苓三萜酸、茯苓多糖[5]、远志皂苷类[6]、人参皂苷类[7]及以β-细辛醚为代表的挥发性成分[8,9,10]。

经典名方制剂工艺研究包括物质基准制备和复方制剂制备，制剂制备工艺过程包括样品前处理、提取、滤过、干燥、制剂成型、工艺验证等内容。传统散剂、汤剂的开放式放置时间短，挥发性成分损失较少。在现代制剂过程中，浓缩干燥等工艺环节可能导致挥发性成分损失较大。开心散中挥发性成分是其重要的药效成分，如何提高包括挥发性成分在内的各种活性成分在饮片-中间体-制剂逐级传递过程的转移效率，是制剂提取工艺研究的关键环节[11,12]。为提高开心散活性成分转移利用效率，本实验采用石菖蒲挥发油提取、β-环糊精包合后，水煎煮提取的工艺，应用响应面法、均匀设计法优化相应制剂条件，确定开心散制剂提取工艺。

1、材料与方法

1.1 仪器

LC-16型高效液相色谱仪(日本岛津公司),HBS-1096C酶标分析仪(南京德铁生物科技有限公司);KDM型调温电热套(菏泽市牡丹区大华仪器有限公司);电热恒温水浴锅(北京市用光明医疗仪器有限公司);TH2-82型水浴恒温振荡器(常州市恩培仪器制造有限公司);DF- 101S 集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司);数显电动搅拌器(方科仪器有限公司);DHG-9070A 电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试药

β-环糊精(北京索莱宝科技有限公司);无水葡萄糖(天津市津科精细化工研究所);苯酚(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);硫酸(国药集团化学试剂有限公司);香草醛(上海市阿拉丁生化科技股份有限公司);冰乙酸(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司);高氯酸(天津市凯信化学工业有限公司);甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

远志(山西吕梁产，批号：20181208);石菖蒲(黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号：D20110101)、人参(黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号：B20091602-01)、茯苓(黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号：D22040801)。经辽宁中医药大学邸学高级实验师鉴定，确定来源分别为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf的干燥菌核、天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott.的干燥根茎、远志科植物远志Polygala tenuifolia Willd.的干燥根。

2、方法

2.1 石菖蒲挥发油提取包合工艺考察

本课题组前期研究确定石菖蒲挥发油提取工艺[13]:称取石菖蒲药材适量，加入8倍量水浸泡1 h后，水蒸气蒸馏法加热提取8 h, 收集石菖蒲挥发油，4 ℃保存备用。

挥发油包合方法：根据预实验结果，选择饱和水溶液法对石菖蒲挥发油进行包合[14]。精密称定β-环糊精，加水8倍量，40 ℃搅拌30 min使溶解，滴入经等体积无水乙醇稀释的挥发油溶液1 mL,40 ℃搅拌40 min, 取出，低温冷藏24 h后抽滤，用少量无水乙醇洗涤包合物，50 ℃干燥，即得包合物。

2.1.1 指标成分β-细辛醚的测定

色谱条件Phenomsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),流动相甲醇(A)∶水(B)(50∶50),流速1.0 mL·min-1,进样量10 μL,柱温35 ℃,检测波长254 nm。

供试品溶液制备：精密称取包合物0.1 g, 置锥形瓶中，精密加入10 mL甲醇超声30 min, 0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

标准品溶液制备：取β-细辛醚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液即得。

测定方法：分别吸取供试品溶液与对照品溶液各3 μL,注入液相色谱仪，测定，即得。

2.1.2 包合工艺单因素考察

分别以包合温度(30、35、40、45、50 ℃)、包合时间(40、80、120、160、200 min)、投料比(2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1)为影响因素进行实验，考察各因素对β-细辛醚含量影响。单因素实验得到的最佳工艺条件为包合温度40 ℃,包合时间160 min, 投料比1∶8。

2.1.3 响应面设计法优化挥发油包合工艺研究

在单因素实验基础上，以投料比(X1)、包合时间(X2)、包合温度(X3)为自变量，β-细辛醚含量为评价指标，结合响应面法优选挥发油的β-环糊精包合工艺条件。根据Box-Behnken模型设计的实验方案进行实验，每个因素设计3个水平，X1(6、8、10),X2(40、45、50 ℃),X3(80、120、160 min)。方案见表1。

2.2 均匀设计法优化开心散提取工艺研究

以总多糖含量、总皂苷含量及出膏率综合为评价指标，将总多糖含量、总皂苷含量、浸膏率的权重系数分别设定为60、30、10。以提取料液比(X1,7～12)、提取时间(X2,0.5～3)、提取次数(X3,1～3)设计U6(63)均匀设计实验表，进行实验。测定总多糖总皂苷含量及浸膏率。实验设计方案及指标测定评分结果见表4。

2.2.1 比色法测定总多糖及总皂苷含量

总多糖测定：精密称定无水葡萄糖对照品适量，以甲醇为溶剂，分别配制得0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.3 mg/mL、0.35 mg/mL的标准溶液。精密吸取不同浓度的葡萄糖标准溶液20 μL,加入50 μL 5%苯酚溶液，最后迅速加入180 μL硫酸，30 ℃振摇15 min显色。在490 nm处测定吸收值。以无水葡萄糖对照品浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，得线性回归方程y=2.333x+0.123 8,r=0.999 6。精密吸取各实验组样品溶液，同法测定，根据回归方程计算多糖含量。

总皂苷含量测定：精密称定人参皂苷Re标准品适量，以甲醇为溶剂，分别配制得0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL标准品溶液。分别精密吸取不同浓度的标准品溶液20 μL,加入20 μL 5%香草醛-冰乙酸溶液20 μL,然后加入80 μL高氯酸，60 ℃水浴加热15 min, 迅速加入冰乙酸80 μL。在555 nm处测定吸光度。以人参皂苷Re对照品浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，得线性回归方程y=1.676x+0.214,r=0.999 7。精密吸取各实验组样品溶液，同法测定，根据线性回归方程计算总皂苷含量。

2.2.2 出膏率测定

取各实验组开心散样品溶液适量，置于105 ℃干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h, 置干燥器中冷却30 min, 迅速精密称定质量，计算出膏率(%)。

3、实验结果

3.1 包合条件单因素考察实验结果

随着包合温度的升高，β-细辛醚含量呈先增加后降低趋势，当包合温度达到45 ℃时，β-细辛醚含量至最大值，此时包合物至平衡状态。后随包合温度逐渐升高，β-细辛醚含量综合评分呈下降趋势，当包合温度达到50 ℃时，温度升高，分子热运动加剧，导致包合物脱包合。随着包合时间增加，β-细辛醚含量呈先增加后降低趋势。当包合时间达到120 min时，β-细辛醚含量达到最大值，此时包合物至平衡状态，分子充分接触，包合效率最高。

随着投料比逐渐增加，β-细辛醚含量呈先增加后降低趋势。这可能是因为投料比较低时，不足以完全包合挥发油，导致包合率较低，当投料比逐渐增加时，挥发油包合率及包合物收得率逐渐增加，β-细辛醚含量也随之增加。当投料比达到8∶1时，此时包合过程效率达到平衡状态，当投料比再次增加时，包合率再次降低，这可能与β-环糊精-挥发油聚合物达到饱和后阻碍挥发油继续进入β-环糊精-挥发油空腔有关。

3.2 Box-Behnken Design(BBD)响应面法优化挥发油包合工艺研究结果

根据Box-Behnken Design(BBD)模型实验设计结果见表1。

表1 响应面设计实验结果

3.3 工艺验证实验

根据Design expert 13.0软件对实验结果的分析，软件预测的最佳包合工艺条件为：β-环糊精与挥发油比例为6∶1,包合温度40 ℃,包合时间为80 min。在该包合条件下，β-细辛醚含量的预测值为89.7%。按照上述优化条件制备3批挥发油包合物，测定β-细辛醚含量。3次实验结果分别为88.9%、90.3%和89.5%(见表2)。由实验验证结果可知，实际值与响应面设计预测结果基本一致，说明该包合工艺稳定、可行。

模型拟合与方差分析：利用Design-Expert 13.0统计软件对表1数据进行二次多项式拟合，获得综合评分对自变量A、B、C的二项式拟合方程。通过P(0.235 2)值大小及相关系数r(0.832 4)判定回归方程拟合情况。根据二项式回归方程方差分析，PA(0.426 7);PB(0.770 1);PC(0.105 4),综合评分因素影响顺序为C>A>B。

表2 包合实验验证结果

3.4 均匀设计法优化开心散提取工艺实验结果

均匀设计优化开心散提取工艺实验结果见表3。以总得分(3项得分之和)为因变量，以提取料液比(X1)、提取时间(X2)、提取次数(X3)为自变量，采用DPS软件(9.5.0标准版)对实验结果进行二次多项式逐步回归分析，得到总得分与各因素的回归方程为y=29.748 622 39+0.184 668 448 53 X1*X1+0.175 244 352 86 X1*X2+1.692 255 150 7 X1*X3。检验回归方程，得到相关系数检验值r=0.999 5,显著水平P=0.001 6<0.05,表明回归方程拟合度高，且差异具有统计学意义。各因素对开心散提取工艺优化总得分的影响顺序为提取次数>提取料液比>提取时间。综合确定提取工艺条件为：提取料液比为1∶12,提取时间为3 h, 提取次数为3次。

表3 均匀设计法实验设计与提取工艺优化结果

3.5 工艺验证

根据均匀设计实验结果，利用最优提取条件进行验证实验，进行3组平行实验。实测结果与回归方程的预测值相近，表明模型拟合效果良好，说明此提取工艺稳定、可行。

3.6β-细辛醚转移率测定

精密称定开心散药材粉末1.0 g, 加70%甲醇20 mL,超声提取50 min, 0.22 μm微孔滤膜滤过，作为开心散散剂供试品溶液。

将开心散药材按照上述“3.5”项下水提取工艺进行直接提取、浓缩至浸膏，50 ℃干燥后，精密称定浸膏粉适量，加70%甲醇20 mL,超声提取50 min, 0.22 μm滤过，作为水提物供试品溶液。

按优化工艺条件，将开心散药材中石菖蒲药材提取挥发油后，与其他药材合并继续提取、浓缩至浸膏，干燥后，浸膏粉加入挥发油包合物混合备用。取适量混合物加70%甲醇20 mL,超声提取50 min, 0.22 μm滤过，作为合挥发油提取物供试品溶液.

取各供试品溶液，采用“2.1.1”项下方法进行β-细辛醚含量测定。

含挥发油包合物的水提物中间体β-细辛醚转移率=(含挥发油提取物β-细辛醚含量/开心散散剂中β-细辛醚含量)×100%

实验结果显示，含挥发油提取物细辛醚转移率为94.94%,由于提取温度过高，开心散中β-细辛醚为主的挥发性成分损失，水提取物中没有测到β-细辛醚。挥发油包合过程提高了石菖蒲药材中β-细辛醚为主的挥发性有效成分利用率。

4、结果与讨论

(1)经典名方作为体现中药复方配伍理论的重要载体，往往是由多种成分共同作用而起效，不同的制剂提取工艺常会导致其成分组成和相对含量的变化，因此，制剂提取工艺研究是经典名方开发的关键环节。经典名方开发需要以“遵古”为首要原则，经典名方制剂开发的难点是古籍记载的煎煮工艺不详，难以保证开发的经典名方制剂的安全性及有效性。本实验采用Box-Behnken实验设计方法优化其中石菖蒲挥发油包合工艺；以总多糖含量、总皂苷含量、出膏率为指标，通过均匀设计实验考察提取料液比、时间和次数，对经典名方开心散进行制剂提取工艺研究，提高成分转移率，以确保开心散新制剂质量的一致性与疗效的稳定性。

(2)Box-Behnken-响应面分析法采用多元线性拟合，能够在因素与响应值之间建立模型，通过数据拟合筛选出最佳工艺，可分析信息丰富，方法精密度高，克服了正交设计只能给出最佳组合因素水平却无法给出最佳组合的缺点。本实验在单因素实验基础上，采用该方法考察了包合温度、包合时间、投料比对挥发油包合率及包合物收得率的综合评分影响，优化开心散中挥发油-β-环糊精包合物的包合工艺条件，得到的最佳工艺为β-环糊精与挥发油比例为6∶1,包合温度40 ℃,包合时间为80 min。

本实验采用β-环糊精进行挥发油包合，可最大程度保留石菖蒲药材挥发性成分，提高石菖蒲活性成分利用率。通过验证试验表明，含挥发油包合物的水提物中间体挥发类成分转移率最高，所得工艺条件稳定可行。

(3)本实验采用均匀设计法对提取料液比、提取时间、提取次数对开心散提取工艺进行优化，对总多糖含量得分、总皂苷含量得分、浸膏率得分赋予权重，使得评价指标更为科学合理。最终确定的最佳工艺为：提取料液比为1∶12,提取时间为3 h, 提取次数为3次。提取工艺优化验证结果证明，均匀设计法优化开心散提取工艺的方法可行，提取效率高。

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基金资助:辽宁省科技厅自然科学基金项目(20180550681);沈阳市科技局重点实验室项目(skf20174703);辽宁中医药大学创新创业项目(X202110162046);

文章来源:姜璐,孙婉婷,李天媛,等.经典名方开心散制剂工艺研究[J].亚太传统医药,2024,20(04):54-57.