槐树(Sophora japonica L.)为豆科(Lenguminosae)槐属(Sophora)多年生落叶乔木，是一种集材用、药用、食用、观赏于一体的优良树种[1]。其干燥花蕾俗称槐米，富含芦丁、槲皮素等活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、止血等活性，是广西“十珍”特色药材，被广泛应用于医药、功能性食品和化妆品中，具有很高的经济价值[2]。金槐(Sophora japonica Cv.Jinhuai)是从槐树中选育出来的优良品种，其槐米中的芦丁含量高达35%以上[3],因其产出的槐米呈金黄色而得名[4]。如今在广西桂北地区被视作经济树种广泛种植，种植面积已达2 000 hm2左右[5]。目前对于槐树活性成分的研究报道多集中于槐米、槐花、槐角，鲜少有关于枝叶的研究报道，且种植户种植的金槐也多用于采摘槐米，对于修剪下来的枝叶鲜少利用，造成了一定的资源浪费。因此，本实验利用抗氧化和α-葡萄糖苷酶的抑制作用对金槐枝叶不同极性部位进行活性评价，筛选金槐枝叶的活性部位，并对其开展化学成分研究，研究结果将为阐明金槐枝叶抗氧化和α-葡萄糖苷酶的抑制活性的物质基础提供依据，也为加强金槐的综合利用，提高金槐种植业的经济效益提供参考。

1、材料与方法

1.1 主要仪器与设备

AVANCE III HD-500 MHZ超导核磁共振仪(瑞士Bruker公司);LC-20AT 液相色谱仪、LC-2030C 3D 液相色谱仪(日本岛津公司);Tecan Spark 多功能酶标仪(瑞士Tecan公司);T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);XS205 型精密分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

1.2 材料与试剂

金槐枝叶于2017年10月在广西桂林采摘，经广西植物研究所唐辉研究员鉴定为金槐(Sophora japonica Cv.Jinhuai)的枝叶；ABTS法抗氧化能力检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(东京化成工业株式会社);α-葡萄糖苷酶、对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(美国Sigma-Aldrich公司);D101大孔树脂(安徽三星树脂科技有限公司);C18填料(北京绿百草科技发展有限公司);GF254硅胶板(青岛海洋化工厂);乙腈为色谱纯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);其余试剂均为分析纯(西陇化工股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 金槐枝叶不同萃取部位的制备

金槐枝叶20 kg, 阴干后粉碎，过50目筛，置于95%乙醇中浸泡48 h, 过滤，收集滤渣重复上述操作2次，合并过滤所得的提取液，浓缩得黏稠墨绿色浸膏，保留部分样品干燥备用，将余下浸膏于水中悬浮，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇逐级萃取3次，减压回收溶剂进行干燥，分别得到石油醚部位1 150 g、乙酸乙酯部位752 g、正丁醇部位963 g以及水部位698 g。

1.3.2 金槐枝叶不同萃取部位的抗氧化活性

(1)清除DPPH自由基活性。

DPPH自由基清除能力的测定方法参照黄思思等[6]所用方法制定并稍作修改。准确称取DPPH 19.718 mg, 加入无水乙醇制备成0.1 mmol/L的DPPH 储备液待用。首先吸取不同浓度的待测样品溶液2 mL置于10 mL具塞玻璃试管中，再加入2 mL的DPPH·储备液，涡旋混匀后，避光反应20 min, 在波长517 nm处测定其吸光度值，每个样品平行测定3次。以维生素C为阳性对照，按照清除率(%)=[A空白–(A样品-A对照)]/A空白×100%(A空白为2 mL样品溶剂+2 mL DPPH 储备液的吸光度值；A样品为2 mL样品溶液+2 mL DPPH 储备液的吸光度值；A对照为2 mL样品溶液+2 mL无水乙醇溶液的吸光度值),计算各样品系列浓度下的清除率，并应用SPSS 18.0软件求出相应的IC50值。

(2)清除ABTS+自由基活性。

参照ABTS法抗氧化能力检测试剂盒的操作步骤，96孔板中每孔加入200 μL的ABTS+工作液，不同浓度的待测样品溶液10 μL,37 ℃反应5 min后，在波长734 nm处测定其吸光度值，实验重复3次。以维生素C为阳性对照，按照清除率(%)=[A空白-(A样品-A对照)]/A空白×100%(A空白为10 μL的样品溶剂+200 μL ABTS+工作液的吸光度值；A样品为10 μL样品溶液+200 μL ABTS+工作液的吸光度值；A对照为10 μL样品溶液+200 μL的80%乙醇的吸光度值),计算各样品系列浓度下的清除率，并应用SPSS 18.0软件求出相应的IC50值。

1.3.3 金槐枝叶不同萃取部位对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

采用PNPG法测定α-葡萄糖苷酶的活性，参照文献[7]所用方法，并稍作修改，将50 μL磷酸盐缓冲液(浓度50 mmol/L,pH=6.8)加入96孔板中，再加入20 μL待测样品和10 μL酶液(1 U/mL),震荡混匀，置于37 ℃恒温箱中预热5 min, 然后加入20 μL PNPG(1 mmol/L),置于37 ℃恒温箱中孵育30 min, 最后加入50 μL无水碳酸钠溶液(0.2 mol/L)终止反应，在波长405 nm处测定吸光度值。同时设定酶活性组(酶+PNPG)、酶空白组(PNPG)、样品组(酶+样品+PNPG)和样品对照组(样品+PNPG),实验过程中加磷酸盐缓冲液补足总体积。以阿卡波糖为阳性对照，按照酶活性抑制率=[(A酶活性-A酶空白)-(A样品-A样品对照)]/(A酶活性-A酶空白)×100%,计算各样品系列浓度下的酶活性抑制率，并应用SPSS 18.0软件求出相应的IC50值。

1.3.4 化学成分的分离

选取体外活性较好的萃取部位进行化学成分分离。取该部位样品700 g, 经D101大孔树脂柱色谱吸附，依次用30%、50%、70%、95%体积分数的乙醇梯度洗脱，收集流分，减压回收溶剂得到30%部分、50%部分、70%部分、95%部分。

取50%部分86 g, 注入C18柱，使用不同体积分数的甲醇(10%、20%、30%、40%、50%、100%)进行梯度洗脱，参考薄层色谱(TLC)结果合并，获得9个组分Fr.1～Fr.9。Fr.2组分经HPLC(0～40 min, 23%乙腈，乙腈-水)制备得到化合物1(25.6 mg);Fr.3组分经HPLC(0～50 min, 10%～35%乙腈，乙腈-水)制备得到化合物2(18.6 mg)、化合物3(13.6 mg)、化合物4(10.3 mg)和化合物5(12.6 mg)。

1.3.5 化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

精密称取5个化合物各2.0 mg, 以二甲基亚砜溶解配制成1 mg/mL的母液，进行梯度稀释，按“1.2.3”项中的方法测定各化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

2、结果与分析

2.1 金槐枝叶各萃取部位抗氧化能力

以样品对自由基的半数清除率(IC50)测评其抗氧化能力，IC50值越小，清除自由基能力越强，则抗氧化能力越强。研究发现，金槐枝叶具有较好的清除DPPH和ABTS自由基的能力，其中乙酸乙酯部位清除能力最强，其次正丁醇部位，石油醚部位和水部位清除能力较弱。见表1。

表1 金槐枝叶各萃取部位抗氧化活性IC50

2.2 金槐枝叶各萃取部位抑制α-葡萄糖苷酶的活性

α-葡萄糖糖苷酶是位于小肠内参与葡萄糖苷水解的关键酶，被视为糖尿病治疗的重要药物靶点之一[8]。α-葡萄糖苷酶抑制剂可干扰糖苷的水解，进而延缓或抑制葡萄糖在肠道内的吸收，从而有效降低餐后血糖。研究发现，金槐枝叶粗提具有与阿卡波糖相当的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，在各萃取部位中，乙酸乙酯部位抑制活性最佳，且明显优于阿卡波糖。见表2。

表2 金槐枝叶各萃取部位抑制α-葡萄糖苷酶的活性

2.3 化合物的结构鉴定

化合物1:黄色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ:6.21 (1H,d, J=2.0 Hz, H-6),6.39 (1H,d, J=1.5 Hz, H-8),7.67 (1H,d, J=15.0 Hz, H-2′),6.88 (1H,d, J=8.5 Hz, H-5′),7.64 (1H,dd, J=8.5,2.0 Hz, H-6′),5.10 (1H,d, J=8.0 Hz, H-1″),1.12 (3H,d, J=6.0 Hz, H-6).13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ:158.5 (C-2),135.6 (C-3),179.4 (C-4),163.0 (C-5),100.0 (C-6),166.0 (C-7),94.9 (C-8),159.3 (C-9),105.6 (C-10),123.1 (C-1′),116.1 (C-2′),149.8 (C-3′),145.8 (C-4′),117.7 (C-5′),123.6 (C-6′),102.4 (C-1″),75.7 (C-2″),78.2 (C-3″),71.4 (C-4″),77.2 (C-5″),68.6 (C-6″),104.7 (C-1),72.1 (C-2),72.2 (C-3),73.9 (C-4),69.7 (C-5),17.9 (C-6)。以上数据与文献数据一致[9],故确定该化合物1为芦丁(rutin)。

化合物2:淡黄色针晶。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ:8.07 (2H,d, J=8.5 Hz, H-3′,5′),6.90 (2H,d, J=8.5 Hz, H-2′,6′),6.39 (1H,S,H-8),6.20 (1H,S,H-6),5.13 (1H,d, J=7.0 Hz, H-1″),4.52 (1H,S,H-1),3.80 (1H,d, J=10.0 Hz, H-6″),1.12 (3H,d, J=6.5 Hz, H-6),13C-NMR (125 Hz, CD3OD) δ:158.5 (C-2),135.5 (C-3),179.3 (C-4),163.0 (C-5),100.0 (C-6),166.0 (C-7),94.9 (C-8),159.4 (C-9),105.6 (C-10),122.7 (C-1′),132.4 (C-2′,6′),116.1 (C-3′,5′),161.4 (C-4′),104.7 (C-1″),75.7 (C-2″),78.1 (C-3″),71.4 (C-4″),77.2 (C-5″),68.6 (C-6″),102.4(C-1),72.1 (C-2),72.3 (C-3),73.9 (C-4),69.7 (C-5),17.9 (C-6)。以上数据与文献[10,11]报道基本一致，故鉴定化合物2为山柰酚3-O-芸香糖苷(kaempferol-3-rutinoside)。

化合物3:淡黄色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ:8.09 (2H,d, J=8.5 Hz, H-2′,6′),6.89 (2H,d, J=8.5 Hz, H-3′,5′),6.41 (1H,brs, H-8),6.21 (1H,s, H-6),5.02 (1H,d, J=7.5 Hz, Gal-H-1),4.51 (1H,s, Rha-H-1),3.72 (1H,dd, J=4.5,10.0 Hz, Gal-H-6),3.39 (1H,dd, J=7.0,10.0 Hz, Gal-H-6),1.19 (3H,d, J=6.5 Hz, Rha-H-6),3.59～3.79 (8H,rfl, sugar-tt).13C-NMR (125 MHz, CD3OD):δ:158.7 (C-2),135.7 (C-3),179.3 (C-4),163.1 (C-5),100.1(C-6) 167.2 (C-7),95.1 (C-8),159.5 (C-9),105.6 (C-10),122.7 (C-1′),132.4 (C-2′,6′),116.1 (C-3′,5′),161.6 (C-4′),105.6 (Gal-C-1),72.1 (Gal-C-2),75.1 (Gal-C-3),70.1 (Gal-C-4),75.4 (Gal-C-5),67.5 (Gal-C-6),102.0 (Rha-C-1),73.0 (Rha-C-2),72.3 (Rha-C-3),73.9 (Rha-C-4),69.7 (Rha-C-5),18.0 (Rha-C-6)。以上数据与文献[10,11,12]报道基本一致，故鉴定化合物3为山柰酚3-O-洋槐糖苷(Kaempferol 3-O-robinobioside)。

化合物4:淡黄色粉末。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ:8.00 (2H,d, J=9.0Hz, H-2′,6′),6.90 (2H,d, J=9.0 Hz, H-3′,5′),6.38 (1H,d, J=2.1 Hz, H-8),6.18 (1H,d, J=2.1 Hz, H-6),5.58 (1H,d, J=7.5 Hz, Gal-H-1),5.22 (1H,S,2″-Rah-H-1),4.50 (1H,S,6″-Rah-H-1).13C-NMR (125 Hz, CD3OD) δ:162.2(C-2),134.3 (C-3),179.3 (C-4),163.1 (C-5),100.1(C-6) 165.8 (C-7),95.1 (C-8),158.5 (C-9),106.1 (C-10),123.2 (C-1′),132.1 (C-2′,6′),116.2 (C-3′,5′),159.1 (C-4′),100.5 (Gal-C-1),79.9 (Gal-C-2),78.9(Gal-C-3),71.9 (Gal-C-4),77.1(Gal-C-5),68.3 (Gal-C-6),102.6 (2″-Rha-C-1),72.4 (2″-Rha-C-2),72.3 (2″-Rha-C-3),74.1 (2″-Rha-C-4),69.9 (2″-Rha-C-5),17.5 (2″-Rha-C-6),102.3 (6″-Rha-C-1),72.1(6″-Rha-C-2),72.3 (6″-Rha-C-3),74.1(6″-Rha-C-4),69.7 (6″-Rha-C-5),17.8 (6″-Rha-C-6)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定化合物4为Kaempferol 3-(2Grhamnosylrutinoside)。

化合物5:淡黄色粉末。1H-NMR (500 MHZ,CD3OD) δ:8.04 (2H,d, J=8.5 Hz, H-2′,6′),6.88 (2H,d, J=9.0 Hz, H-3′,5′),6.36 (1H,d, J=1.9 Hz, H-8),6.18 (1H,d, J=1.9 Hz, H-6),5.55 (1H,d, J=7.5 Hz, Gal-H-1),5.21 (1H,S,2″-Rah-H-1),4.52 (1H,S,6″-Rah-H-1).13C-NMR (125 Hz, CD3OD) δ:158.1(C-2),134.4 (C-3),177.3 (C-4),163.3 (C-5),100.1(C-6) 164.3 (C-7),95.1 (C-8),163.2(C-9),106.1 (C-10),123.2 (C-1′),132.1 (C-2′,6′),116.2 (C-3′,5′),158.7 (C-4′),102.6 (Gal-C-1),77.7 (Gal-C-2),75.7(Gal-C-3),70.7(Gal-C-4),75.3(Gal-C-5),67.1 (Gal-C-6),101.8(2″-Rha-C-1),72.4 (2″-Rha-C-2),72.3 (2″-Rha-C-3),74.1 (2″-Rha-C-4),69.7 (2″-Rha-C-5),17.5 (2″-Rha-C-6),100.8(6″-Rha-C-1),72.4(6″-Rha-C-2),72.1 (6″-Rha-C-3),73.8(6″-Rha-C-4),69.8 (6″-Rha-C-5),17.9 (6″-Rha-C-6)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定化合物5为Kaempferol 3-O-(2,6-di-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-galactopyranoside。

2.4 金槐枝叶化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

研究发现，各化合物均对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性，化合物4和化合物5的抑制活性与阿卡波糖相当，化合物1～3的抑制活性优于阿卡波糖。通过结构关系分析发现，该类化合物中糖的数量是影响α-葡萄糖苷酶抑制活性的关键，糖的数量越多，活性越弱；另外B环上3′-位羟基对α-葡萄糖苷酶的抑制活性也有一定的影响，若3′-位无羟基，则其活性降低。见表3。

表3 金槐枝叶化合物抑制α-葡萄糖苷酶的活性

3、结语

本实验通过多种模型筛选出金槐枝叶抗氧化和α-葡萄糖苷酶的抑制活性的最优部位均为乙酸乙酯部位，并从中分离纯化得到5个黄酮苷类化合物，分别为芦丁、山柰酚3-O-芸香糖苷、山柰酚3-O-洋槐糖苷、Kaempferol 3-(2Grhamnosylrutinoside)、Kaempfe- rol 3-O-(2,6-di-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-galactopyranoside, 且5个化合物都对α-葡萄糖苷酶表现出了良好的抑制活性，化合物1～3甚至优于阿卡波糖。黄酮苷类化合物是植物中普遍存在一类次生代谢产物，具有广泛的药理活性和较高的应用价值。芦丁(化合物1)具有抗心肌损伤、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等活性[15];山柰酚3-O-芸香糖苷(化合物2)具有改善脑血管性痴呆症状和记忆保护的作用[16],此外，还对血管平滑肌细胞的增殖和迁移具有抑制作用，从而延缓动脉粥样硬化的进程[17];山柰酚3-O-洋槐糖苷(化合物3)具有抗单纯疱疹病毒[18]和抑制人淋巴细胞增殖[19]的作用。结合本实验结果可知，黄酮苷类化合物应当为金槐枝叶的重点活性成分之一。因此，本实验结果阐明了金槐枝叶抗氧化和α-葡萄糖苷酶的抑制活性的物质基础，为金槐枝叶在抗氧化和降糖活性方面产品的开发和应用提供了科学依据。

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基金资助:广西创新驱动发展专项(桂科AA22096020-3);

文章来源:邱显雯,符毓夏,潘争红,等.金槐枝叶活性部位筛选及其化学成分研究[J].亚太传统医药,2024,20(04):44-48.