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APX-115 free base对H9c2细胞抵抗高浓度葡萄糖的保护效果

2024-12-30 84 上传者：管理员

摘要：目的:了解Nox抑制剂APX-115 free base对H9c2细胞抵抗高浓度葡萄糖的保护效果｡方法:通过CCK8法检测H9c2细胞在不同浓度APX-115 free base预处理后的增殖活力;Western blot法和免疫荧光法检测Nox4蛋白的表达;并观察细胞形态的变化｡结果:与Model组相比,APX-115 free base浓度为8μmol/L时,细胞增殖活力下降,其他浓度时,细胞增殖活力上升;APX-115 free base各处理组的Nox4蛋白表达均下调;APX-115 free base 5μmol/L处理组的细胞形态恢复梭形,细胞分布逐渐均匀,细胞间空隙减少,细胞数量基本恢复到正常水平｡结论:5μmol/L时的APX-115 free base对高糖诱导下H9c2细胞的保护效果最佳｡

关键词：
APX-115
H9C2细胞
Nox抑制剂
保护效果
高糖诱导
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活性氧( Reactive Oxygen Species,ROS)是体内的一类单电子还原产物,它的化学性质类似于氧｡还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶( NicotinamideAdenine Dinucleotide Phosphate Oxidase,Nox)是产生ROS的主要酶类之一,是对抗入侵细菌的重要炎症介质｡当机体内Nox介导的ROS生产过多时会导致多种慢性疾病的发生[1]｡Nox4作为诱导心肌细胞中ROS的产生的主要参与者,在心肌损伤后的Ca2 +调控､线粒体再生､大量ROS的生成和炎症反应中发挥巨大作用｡多种研究结果显示,当心肌中Nox过表达时,会引起ROS过量生成,从而诱发氧化应激､细胞凋亡等心肌损伤[2 - 8]｡此外,有证据表明,小鼠心脏Nox4的特异性过表达可引起心肌细胞的氧化应激和纤维化[8]｡Shah AM的研究结果证实,当心肌中Nox4高表达时,由血管紧张素Ⅱ介导的心肌重构被加重,而当抑制Nox4后,心脏机能被明显改善[9]｡因此,Nox可能成为治疗疾病的靶点｡Nox抑制剂可以通过阻断氧化酶的电子传递链,从而阻断氧化应激的发生[10]｡目前还没有有效的特异性Nox抑制剂｡而常用于研究的Nox抑制剂包括通过抑制Nox产生ROS来降低氧化应激的罗布苷､二苯二碘铵氯化铵,以及一些新肽抑制剂,包括gp91ds - tat和新型非肽VAS - 2870[11]｡有研究显示Nox抑制剂可以作为帕金森病的新疗法[12 - 13],也可以减轻酒精肝小鼠肝细胞损伤和脂代谢的紊乱[14]｡gp91ds - tat可以缓解瓦斯爆炸引起的大鼠肺损伤[15]｡APX - 115 free base[3 -苯基- 1 - (吡啶- 2 -基) - 4 -丙基- 1 - 5 -羟基吡唑HCl]是一种口服的非选择性Nox抑制剂,它可能是通过广泛介导抑制各种Nox亚型发挥作用的[16]｡目前,对于APX -115 free base的研究多集中在对糖尿病肾病的治疗[17 - 20]｡而糖尿病患者体内肾脏损伤的同时,往往也伴随有不同程度的心肌损伤,而这些损伤常常由Nox的过表达诱发,但是,目前对APX - 115 freebase预防高糖环境下的心肌细胞损伤的研究较少,且APX - 115 free base对不同细胞的作用效果也不相同｡本研究的目的在于通过检测H9c2细胞的增殖活力及Nox4的表达,了解APX - 115 free base对H9c2细胞抵抗高浓度葡萄糖的保护效果｡

1、材料与方法

1. 1主要试剂

APX - 115 free base( HY - 120801A-5 mg)购自MCE,用二甲基亚砜( DMSO)溶解,并配制成5 mmol /L的母液避光储存于- 20℃ 冰箱中｡DMSO( D2650 - 100 mL)购自Solarbio; CCK8细胞增殖检测试剂盒( BS350B)购自Biosharp;青-链霉素双抗( 15 140 122)､胎牛血清( FBS) ( 10 270 - 106)､0. 25% EDTA胰蛋白酶( 25 200 072)均购自Gibco;DMEM低NaHCO3培养基( iCell -128 -0001)购自上海赛百慷公司; GAPDH抗体( Cat#AF7021)购自Affinity Biosciences; PBS溶液(磷酸盐缓冲液)( B310KJ)购自上海源培; Nox4抗体( bs - 1091R)购自Bioss;蛋白定量试剂盒( BCA法) ( A045 - 4 - 2)购自北京普利莱｡

1. 2细胞培养

大鼠心肌细胞H9c2( 2 - 1)细胞株购自中国科学院上海细胞库｡H9c2细胞在含有10% FBS和1%青-链霉素双抗的低NaHCO3培养基中于T75培养瓶中培养,并在含5% CO2的37℃培养箱中培养,待细胞密度达到90%后(大约2 ~3 d)传代,3次稳定传代后的细胞可进行实验｡

1. 3实验分组及细胞处理

实验分为对照组( Control组) ,模型组( Model组) ,APX - 115 free base3 μmol /L处理组､4 μmol /L处理组､5 μmol /L处理组､6 μmol /L处理组､7 μmol /L处理组､8 μmol /L处理组｡见表1｡

表1实验分组及细胞处理

1. 4细胞增殖活力检测

采用CCK8法检测H9c2细胞增殖活力,待细胞生长达80%以上,收集细胞,重悬,计数｡将96孔板细胞数调整为每孔5 000个左右｡96孔板放入37℃ 培养箱中孵育24 h,根据表1的分组处理细胞,每组6个复孔,同时设置空白对照组(只加培养基)｡待细胞处理好后,将96孔板中的培养基弃去,每孔加入100 μL完全培养基,并在每孔中加入10 μL CCK8检测试剂｡37℃培养箱中孵育4 h后,450 nm波长用酶标仪测其吸光度｡并按照计算细胞增殖活力的公式计算各组细胞的增殖活力｡

1. 5 Nox4蛋白表达的检测

细胞按表1处理后,收集细胞,离心后弃上清,并加入适量裂解液,裂解液中提前加入蛋白磷酸酶抑制剂并混合均匀,冰上裂解0. 5 h,期间每隔10 min摇晃混合液一次,用BCA法检测蛋白浓度,并将蛋白浓度调整到同一数值,100℃煮10 min,使之变性;每组样品上样30 μg,12% SDS - PAGE电泳,之后将目标蛋白转移到PVDF膜上; 1ΧTBST洗膜; 37℃的环境中用5%脱脂牛奶( 1ΧTBST配制)封闭50 min;结束后1ΧTBST洗膜;一抗(抗体稀释液稀释)室温孵育30 min; 4℃ 过夜孵育(至少8 h) ; 1ΧTBST洗膜;辣根过氧化物酶标记的二抗( 1ΧTBST按1∶10 000稀释) ,室温孵育2 h;1ΧTBST洗膜;用显影液显影目的条带,内参为GAPDH;对图片使用Image J软件进行扫描分析｡

1. 6形态学检测

选取达到实验要求的细胞洗涤､消化､收集､重悬､计数｡将细胞悬液调整为每毫升中含有5 × 105个细胞,6孔板每孔加2 mL细胞悬液｡按表1进行处理后,普通光学显微镜下观察Control组､Model组和APX - 115 free base 5 μmol /L处理组的细胞形态变化｡

1. 7流式检测

ROS的表达细胞按表1处理后,收集细胞; PBS重悬洗涤两次｡弃上清,每组加100 μL 1 × ROS染色剂( 1 000 μLROS Assay Buffer+ 2 μL 500 × ROS Assay Stain)重悬后37℃CO2培养箱中孵育1 h｡1 000 rpm /min离心5 min,弃上清,PBS洗涤｡离心,弃上清,加1 mL的PBS重悬｡流式上机检测Control组､Model组和APX - 115 freebase 5 μmol /L处理组的ROS的表达量｡

1. 8免疫荧光检测

Nox4的蛋白表达将24孔板专用爬片放入24孔板中,每组2个复孔｡将生长状态良好的细胞用PBS洗涤后,消化､收集､离心､弃上清,重悬后,计数,调整细胞悬液,使其密度在5 × 104个/mL左右,每孔加1 mL细胞悬液｡按表1进行处理后,去除培养基,PBS洗涤｡1 mL /孔4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗涤｡1 mL /孔0. 3%Tritonx - 100通透20 min,PBS洗涤｡200 μL /孔5% BSA封闭2 h,PBS洗涤｡200 μL /孔一抗(用抗体稀释液按抗体说明书的比例稀释) ,4℃ 过夜孵育( 12 h ~ 16 h) ,PBS洗涤｡之后所有步骤在暗处进行,160 μL /孔荧光二抗(用PBS按照说明书的比例稀释)孵育1 h,PBS洗涤｡200 μL /孔DAPI孵育5 min,PBS洗涤｡封片,正置荧光显微镜下观察Control组､Model组和APX - 115 free base 5 μmol /L处理组的蛋白表达情况并采集图像｡

1. 9统计学处理

使用Graphpad Prism 6. 0对实验数据分析､绘图,采用平均值±标准差表示,结果服从正态分布｡用独立样本t检验对2组数据间进行比较,用单因素方差对2组以上的多组数据分析比较,两两比较采用SNK法｡差异有统计学意义用P < 0. 05表示｡

2、结果

2. 1 APX - 115 free base对高糖环境下的H9c2细胞增殖活力的影响

与Control组相比,Model组细胞增殖活力下降( P < 0. 01) ;与Model组相比,APX- 115 free base浓度为8 μmol /L时,细胞增殖活力下降,其他浓度时,细胞增殖活力上升;当APX -115 free base浓度为4 μmol /L时,细胞增殖活力为浓度为5 μmol /L时,细胞增殖活力为( 91. 38 ± 1. 10 ) % ( P > 0. 05 )｡见图1 A｡

2. 2 APX - 115 free base对高糖环境下的H9c2细胞的Nox4蛋白表达的影响

与Control组相比,Model组的Nox4蛋白表达水平上调( P > 0. 05) ;与Model组相比,APX - 115 free base各浓度组Nox4蛋白表达水平均下调,但只有浓度在4 μmol /L和5 μmol /L时具有统计学意义( P < 0. 05) ,且浓度为5 μmol /L时Nox4蛋白表达水平低于4 μmol /L;其他各浓度组Nox4蛋白表达水平量均高于4 μmol /L和5 μmol /L｡见图1 B｡

图1不同浓度APX - 115 free base对高糖诱导H9c2细胞的影响

2. 3 H9c2细胞的形态变化

细胞形态观察显示,Control组的细胞分布均匀,排列紧密,呈梭形,无异形;与Control组相比,Model组的细胞分布不均匀,细胞数量减少,形态异常,细胞间出现空隙;与Model组相比,APX - 115 free base 5 μmol /L处理组的细胞形态恢复梭形,细胞分布逐渐均匀,细胞间空隙减少,细胞数量基本恢复到正常水平｡见图2 A｡

2. 4不同处理条件下H9c2细胞ROS表达量的变化

与Control组相比,Model组的ROS含量上升( P < 0. 01) ;与Model组相比,APX - 115free base5 μmol /L处理组的ROS表达下降( P > 0. 05 )｡见图2 B｡

2. 5不同处理条件下H9c2细胞的Nox4的蛋白表达变化

与Control组相比,Model组的Nox4的蛋白表达水平上升( P < 0. 01) ;与Model组相比,APX -115 free base 5 μmol /L处理组的Nox4的蛋白表达水平下调( P < 0. 01)｡见图2 C｡

图2 APX - 115 free base对高糖诱导的H9c2细胞的影响

3、讨论

有研究发现,Nox抑制剂APX - 115 free base通过激活ERK和JNK - caspase依赖的凋亡信号轴,在EBV感染的视网膜细胞中诱导细胞死亡(凋亡和坏死)[21]｡对于不同细胞或者不同方法处理的相同细胞,APX - 115 free base的最适作用浓度有所不同｡APX -115 free base作用于细胞系的研究很少,目前关于APX -115 free base的研究集中于口服药效的研究｡多个研究显示,小鼠以60 mg /( kg·d)的剂量口服灌胃APX -115 free base可以有效地治疗糖尿病肾病[17 - 19]｡Dorotea等[20]研究显示,大鼠口服不同剂量的APX -115 free base[0. 5､5､30 mg /( kg·d) ]均可治疗糖尿病肾病,且呈剂量依赖性｡在本研究中,前期通过CCK8和WB结果,发现APX - 115 free base的作用浓度为5 μmol /L时,对H9c2细胞抵抗高浓度葡萄糖的保护效果最佳｡之后我们通过形态学观察发现,APX - 115 free base 5 μmol /L处理组的细胞形态恢复梭形,细胞分布逐渐均匀,细胞间空隙减少,细胞数量基本恢复到正常水平｡我们进一步检测了ROS表达量,并选择免疫荧光技术检测Nox4的蛋白表达｡结果显示,与Model组相比,APX - 115 freebase 5 μmol /L处理组的ROS表达下降,同时Nox4的蛋白表达水平显著下调｡综上所述,APX - 115 free base可以通过下调ROS的表达,减少氧化应激,增强细胞增殖活力,缓解H9c2心肌细胞因高糖诱导引起的损伤｡其中APX - 115 free base浓度为5 μmol /L时,对H9c2细胞有最佳的保护作用｡本研究可以为APX - 115free base在高糖诱导的H9c2细胞的损伤预防方面提供实验数据基础,也可以为糖尿病心肌病的药物研发提供参考｡

参考文献:

[14]崔玮,崔迪,欧阳婷,等.抑制NOX缓解酒精肝模型小鼠肝细胞损伤及脂代谢紊乱[J].中国组织工程研究,2022,26( 35) : 5589 – 5595.

[15]张淼,孙蕴哲,曹佳,等. NOX2抑制剂gp91 ds - tat缓解瓦斯爆炸引起的大鼠肺损伤[J].职业卫生与应急救援,2022,40( 06) : 635 - 640.

基金资助:国家自然科学基金地区科学基金项目(82160533);云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项资金项目(2019FE001);

文章来源:卫小娟,李树德,李治刚,等.APX-115 free base对H9c2细胞抵抗高浓度葡萄糖的保护效果[J].包头医学院学报,2024,40(12):8-12+23.