丹参川芎嗪注射液的主要成分为盐酸川芎嗪和丹参素[1]，川芎嗪能够改善微循环、提升红细胞表面电荷和血小板[2]，丹参素具有抗炎、抗血栓、改善心功能及扩张冠脉等诸多药理作用[3,4,5]，主要用于治疗心脑血管疾病，近年来也逐渐应用于糖尿病肾病、慢性阻塞性肺病的治疗[1,6]。目前有关该注射液的报道多集中于临床病例观察，而其给药后的代谢产物鲜有报道。因此，本实验以注射液中主要成分——丹参素和川芎嗪为目标化合物，研究其在大鼠体内的代谢，旨在阐明其在大鼠体内的代谢途径和规律。

随着多级质谱技术的发展，串联质谱技术被应用于药物代谢的定性研究[7]，本实验所采用的超高效液相色谱与四极杆-飞行时间串联质谱联用技术（UPLC-Q/TOF-MS）是研究药物代谢的重要方法之一。超高效液相色谱（UPLC）具有分离效果好、分析速度快的优势，四极杆-飞行时间串联质谱（Q/TOF-MS）具有选择性强、灵敏度高的优点，能够精确地测定分子量，其产生的二级质谱可以提示特征离子碎片[8]，并且结合UNIFI信息系统对代谢产物进行结构鉴定，分析代谢的途径。

1、材料

1.1仪器

FA1104N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司），TGL-16aR型飞鸽超离速离心机（上海安亭科学仪器厂），DCY-12S型氮气吹干仪（青岛海科仪器有限公司），XevoG2-XS型Q/TOF四级杆飞行时间质谱仪、ACQUITYUPLC型二元泵和样品管理器、UNIFI科学信息学系统（美国Waters公司）。

1.2试药

甲酸钠、亮氨酸-脑啡肽（美国Sigma公司），乙腈（质谱级，美国Fisher公司），纯净水（广州屈臣氏食品饮料有限公司），甲醇、乙酸乙酯（分析纯，天津新通精细化工有限公司），丹参素（批号：151106,HPLC≥98%，北京普天同创生物科技有限公司），川芎嗪（批号：150923,HPLC≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司），丹参川芎嗪注射液（规格：5mL/支，批号：20171208，吉林四长制药有限公司），0.9%氯化钠溶液（规格：100mL，批号：F18051002，河北天成药业有限公司）。

1.3实验动物

Wistar大鼠24只，雌雄各半，体质量（200±20)g[辽宁长生生物技术股份有限公司，SCXX（辽）2015-0001]。

2、方法

2.1色谱条件

ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱（100mm×2.1mm,1.7μm），柱温30℃，样品管理器温度15℃，进样体积5μL，流速0.4mL·min-1，流动相A:0.1%甲酸-水；流动相B:0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脱条件：0～2min,10%B;2～26min,10%～90%B;26～28min,90%B;28～29min,90%～10%B;29～30min,10%B。

2.2质谱条件

电喷雾离子化源，采用正、负离子检测模式。扫描范围m/z100～1500。毛细管电压3.0kV，锥孔电压40V，锥孔气流量50L·h-1，脱溶剂氮气流量600L·h-1，氩气流量0.15mL·min-1，源温120℃，脱溶剂气温度300℃。采用亮氨酸-脑啡肽作为校正液（100ng·L-1），对仪器进行实时校正，使用甲酸钠溶液对分子量行校正。

2.3实验动物分组及给药

大鼠在温度22～24℃，相对湿度55%～65%，饮水进食自由的条件下饲养，随机分成空白组、血浆代谢组、尿液/粪便代谢组、胆汁代谢组，各6只，给药前12h禁食不禁水，给药体积为1.8mL·kg-1（根据丹参川芎嗪注射液质量标准[9]，该给药体积相当于丹参素0.72mg·kg-1、川芎嗪36mg·kg-1），在实验过程中涉及到采血和注射的实验操作均事先将大鼠麻醉，实验结束后剩余的大鼠被处以安乐死。

2.3.1血浆代谢组

大鼠经尾静脉给药，分别于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0h眼底取血，置于含肝素钠EP管中待用。

2.3.2尿液、粪便代谢组

大鼠经尾静脉给药，分别放入不同的代谢笼中，收集给药后0～2h、2～4h、4～6h、6～8h、8～12h和12～24h的尿液和粪便，置于冰箱备用。

2.3.3胆汁代谢组

大鼠腹腔注射水合氯醛，待麻醉后，在腹腔十二指肠处切开约3cm的切口，创口越小越有利于长时间收集胆汁，剥离胆管周围脂肪层漏出胆总管，用胆总管插管引流胆汁，用纱布盖住创口，尽量维持大鼠体温，经尾静脉给药。收集给药后0～2h、2～4h、4～6h、6～8h、8～10h、10～12h、12～24h的胆汁，置于冰箱备用。

2.3.4空白组

大鼠经尾静脉给予相同体积的生理盐水，分别放入不同的代谢笼中，收集0～2h、2～4h、4～6h、6～8h、8～12h和12～24h的尿液和粪便，置于冰箱备用，并于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0h眼底取血，置于离心管中待用。继续正常饲养大鼠2d后禁食不禁水12h，收集给药后0～2h、2～4h、4～6h、6～8h、8～10h、10～12h、12～24h的胆汁，置于冰箱备用。

2.4供试样品的制备

2.4.1血浆供试样品的制备

取待用血样，37℃孵化30min,3000r·min-1离心15min，合并各时间点血浆，取合并后血浆200μL，加3倍量甲醇，涡旋3min,13000r·min-1离心10min。吸取上清液并吹干，残留物加入80%甲醇复溶，涡旋3min,13000r·min-1离心10min，取上清液进样[8,10]。

2.4.2尿液供试样品的制备

分别取适量空白、给药各时间点尿液样品共1000μL，加入5mL乙酸乙酯，涡旋3min，超声10min,6000r·min-1离心10min，吸取上清液并吹干，残留物加入80%甲醇充分复溶，涡旋3min,13000r·min-1离心10min，取上清液进样[8]。

2.4.3粪便供试样品的制备

晾干粪样，均匀研磨，分别取适量空白、给药各时间点粪便样品共0.2g，按10mL·g-1加50%甲醇，浸泡、匀浆、超声提取两次，6000r·min-1离心10min，取上清液100μL，加入1000μL乙酸乙酯，震荡2min,6000r·min-1离心10min，吸取上清液并吹干，残留物加入80%甲醇充分复溶，涡旋3min,13000r·min-1离心10min，取上清液进样[8,11]。

2.4.4胆汁供试样品的制备

分别取适量空白组、给药组各时间点胆汁样品共500μL，加4mL甲醇，震荡2min，超声10min,15000r·min-1离心10min，吸取上清液并吹干，重复两次沉淀蛋白，残留物加入50%甲醇充分复溶，涡旋3min,13000r·min-1离心10min，取上清液进样[12,13]。

2.4.5数据处理

将丹参素和川芎嗪结构式导入UNIFI平台，设置正、负离子模式下可能的代谢途径，建立代谢物分析方法，进行数据分析，系统分析母体化合物可能的代谢物结构，通过质谱高能量通道采集碎片离子精确分子质量，确认碎片离子，有助于鉴别代谢物。

3、结果

空白及给药后大鼠血浆、尿样、粪样和胆汁经正、负离子模式检测，得基峰离子图。运用UNIFI平台进行分析，比较样品与空白样品之间的区别，根据分子量及分子式结合高通量质谱图进行人工解析，最终确定代谢产物的结构。

3.1对照品质谱裂解途径解析

3.1.1丹参素对照品质谱裂解途径解析

在负离子模式下，丹参素产生的分子离子峰[M-H]-为197.8056，可推断其分子式为C9H10O5，对其进行MS/MS扫描，产生3个主要碎片离子，碎片m/z=179.3528为母离子失去1个H2O得[M-H-H2O]-峰，碎片m/z=151.0221为母离子失去1个HCOOH得[M-H-HCOOH]-峰，碎片m/z=133.0098为母离子失去1个H2O、1个HCOOH得[M-H-H2O-HCOOH]-峰，其二级质谱图见图1。由此可见，丹参素容易产生脱羟、脱羧的碎片离子，这与丹参素母核中存在羟基和羧基有关，故推测丹参素在体内发生代谢时羟基、羧基基团也易发生反应，而且上述得到的质谱裂解规律可为代谢产物的结构鉴定提供参考。

图1负离子模式下丹参素的二级质谱图

3.1.2川芎嗪对照品质谱裂解途径解析

在负离子模式下，川芎嗪产生的分子离子峰[M-H]-为135.0720，可推断其分子式为C8H12N2，对其进行MS/MS扫描，产生1个主要碎片离子，碎片m/z=120.0639为母离子失去1个CH3得[M-H-CH3]-峰，其二级质谱图见图2。由此可见，川芎嗪容易产生脱甲基的碎片离子，这与川芎嗪母核中存在甲基有关，故推测川芎嗪在体内发生代谢时甲基基团也易发生反应，而且上述得到的质谱裂解规律可为代谢产物的结构鉴定提供参考。

图2负离子模式下川芎嗪的二级质谱图

3.2大鼠血浆中丹参素及川芎嗪代谢产物的鉴定

在大鼠血浆中鉴定出丹参素原形成分（DM0），川芎嗪原形成分（CM0),2个丹参素代谢产物记为丹参素代谢产物1(DM1）、丹参素代谢产物2(DM2）和1个川芎嗪代谢产物记为川芎嗪代谢产物1(CM1），空白和给药后大鼠血浆正负基峰离子流图如图3。

图3空白血浆（A）及给药后大鼠血浆（B）在正（1）、负（2）离子模式下的基峰离子流（BPI）图

DM0：保留时间为1.10min,[M-H]-的分子离子峰m/z为197.6185，其多级质谱裂解行为与丹参素对照品相同，故将DM0鉴定为丹参素。

CM0：保留时间为4.81min,[M-H]-的分子离子峰m/z为135.8799，其多级质谱裂解行为与川芎嗪对照品相同，故将CM0鉴定为川芎嗪。

DM1：保留时间为13.49min,[M+H]+的分子离子峰m/z为357.1149，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C15H16O10，对其进行MS/MS扫描，产生2个主要碎片离子，碎片m/z=310.3475为母离子失去1个HCOOH得[M+H-HCOOH]+峰，碎片m/z=178.1869为母离子失去1个葡萄糖醛酸得[M+H-C6H9O6]+峰，故推测DM1在体内经过了脱羟和葡萄糖醛酸化反应，其二级质谱图见图4中DM1。

DM2：保留时间为11.54min,[M-H]-的分子离子峰m/z为299.1705，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C14H20O7，对其进行MS/MS扫描，产生3个主要碎片离子，碎片m/z=284.1914为母离子失去1个H2O得[M-H-H2O]-峰，碎片m/z=254.1194为母离子失去1个C2H5O得[M-H-C2H5O]-峰，碎片m/z=119.9211为母离子失去1个H2O、1个C6H10O5得[M-H-H2O-C6H10O5]-峰，故推测DM2在体内经过了脱羧、还原和葡萄糖化反应，其二级质谱图见图4中DM2。

CM1：保留时间为4.31min,[M+H]+的分子离子峰m/z为359.1098，结合原形成分川芎嗪的分子结构，判断其分子式为C14H18N2O9，对其进行MS/MS扫描，产生3个主要碎片离子，碎片m/z=313.0429为母离子失去1个HCOOH得[M+H-HCOOH]+峰，碎片m/z=182.3123为母离子失去1个葡萄糖醛酸得[M+H-C6H9O6]+峰，碎片m/z=152.9281为母离子失去1个葡萄糖醛酸、1个OCH2得[M+H-C7H11O7]+峰，故推测CM1在体内经过了羟基化和葡萄糖醛酸化反应，其二级质谱图见图4。

图4DM1、DM2和CM1二级质谱图

3.3大鼠尿液中丹参素及川芎嗪代谢产物的鉴定

在大鼠血浆中共鉴定出5个丹参素代谢产物记为丹参素代谢产物3(DM3）、丹参素代谢产物4(DM4）、丹参素代谢产物5(DM5）、丹参素代谢产物6(DM6）、丹参素代谢产物7(DM7）和1个川芎嗪代谢产物记为川芎嗪产物2(CM2），空白尿液和给药后大鼠尿液正负基峰离子流图如图5。

图5空白尿液（C）及给药后大鼠尿液（D）在正（1）、负（2）离子模式下的基峰离子流（BPI）图

DM3：保留时间为29.81min,[M+H]+的分子离子峰m/z为247.0269，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C9H10O6S，对其进行MS/MS扫描，产生3个主要碎片离子，碎片m/z=201.9043为母离子失去1个HCOOH得[M+H-HCOOH]+峰，碎片m/z=173.0546为母离子失去1个C3H5O2得[M+H-C3H5O2]+峰，碎片m/z=121.1593为母离子失去1个硫酸根、1个HCOOH得[M+H-CH2O5S]+峰，故推测DM3在体内经过了脱羟和硫酸酯化反应。

DM4：保留时间为4.94min,[M-H]-的分子离子峰m/z为289.2668，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C9H6O9S，对其进行MS/MS扫描，产生2个主要碎片离子，碎片m/z=213.9977为母离子失去1个CHOHCOOH得[M-H-C2H3O3]-峰，碎片m/z=162.9433为母离子失去1个硫酸根、1个HCOOH得[M-H-HCOOH-SO3]-峰，故推测DM4在体内经过了脱羟、环化和硫酸酯化反应。

DM5：保留时间为7.40min,[M-H]-的分子离子峰m/z为297.0961，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C14H18O7，对其进行MS/MS扫描，产生2个主要碎片离子，碎片m/z=252.1161为母离子失去1个H2O、失去1个C2H3得[M-H-H2O-C2H3]-峰，碎片m/z=146.0957为母离子失去1个C5H11O5得[M-H-C5H11O5]-峰，故推测DM5在体内经过了脱羧、脱羟和葡萄糖化反应。

DM6：保留时间为22.66min,[M-H]-的分子离子峰m/z为239.0584，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C11H12O6，对其进行MS/MS扫描，产生2个主要碎片离子，碎片m/z=221.0262为母离子失去1个H2O得[M-H-H2O]-峰，碎片m/z=146.0059为母离子失去1个H2O和C2H3O3得[M-H-C2H5O4]-峰，故推测DM6在体内经过了脱羟和乙酰化反应。

DM7：保留时间为25.81min,[M-H]-的分子离子峰m/z为223.0249，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C10H8O6，对其进行MS/MS扫描，产生1个主要碎片离子，碎片m/z=149.9908为母离子失去1个C2H2O3得[M-H-C2H2O3]-峰，故推测DM7在体内经过了脱羟和甲酸化反应。

CM2：保留时间为29.18min,[M+H]+的分子离子峰m/z为213.1031，结合原形成分川芎嗪的分子结构，判断其分子式为C9H12N2O4，对其进行MS/MS扫描，产生3个主要碎片离子，碎片m/z=181.7464为母离子失去1个CH3OH得[M+H-CH3OH]+峰，碎片m/z=154.8114为母离子失去1个CH2COOH得[M+H-C2H3O2]+峰，碎片m/z=107.9281为母离子失去1个CH3、1个CH3OH、1个CH2COOH得[M+H-CH3-CH3OH-C2H3O2]+峰，故推测CM2在体内经过了羟基化和羧基化反应。

3.4大鼠粪便中丹参素及川芎嗪代谢产物的鉴定

在大鼠血浆中共鉴定出2个丹参素代谢产物，与尿液中鉴定的结果一致，分别为DM6和DM7，空白类便和给药后大鼠粪便正负离子模式下基峰离子流图如图6。

图6空白类便（E）及给药后大鼠粪便（F）在正（1）、负（2）离子模式下的基峰离子流（BPI）图

3.5大鼠胆汁中丹参素及川芎嗪代谢产物的鉴定

在大鼠胆汁中共鉴定出3个丹参素代谢产物记为丹参素代谢产物8(DM8）、丹参素代谢产物9(DM9）、丹参素代谢产物10(DM10）和1个川芎嗪代谢产物记为川芎嗪代谢产物3(CM3），空白胆汁和给药后大鼠胆汁正负基峰离子流图如图7。

图7空白胆汁（G）及给药后大鼠胆汁（H）在正（1）、负（2）离子模式下的基峰离子流（BPI）图

DM8：保留时间为4.39min,[M+H]+的分子离子峰m/z为345.0831，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C14H16O10，对其进行MS/MS扫描，产生3个主要碎片离子，碎片m/z=168.2654为母离子失去1个葡萄糖醛酸得[M+H-C6H9O6]+峰，碎片m/z=150.3321为母离子失去1个葡萄糖醛酸、1个H2O得[M+H-H2O-C6H9O6]+峰，碎片m/z=122.2759为母离子失去1个葡萄糖醛酸、1个HCOOH得[M+H-HCOOH-C6H9O6]+峰，故推测DM8在体内经过了脱羟、脱羧、氧化和葡萄糖醛酸化反应。

DM9：保留时间为4.71min,[M-H]-的分子离子峰m/z为220.0620，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C11H11NO4，对其进行MS/MS扫描，产生2个主要碎片离子，碎片m/z=174.9572为母离子失去1个HCOOH得[M-H-HCOOH]-峰，碎片m/z=146.9304为母离子失去1个C2H4NO2得[M-H-C2H4NO2]-峰，故推测DM9在体内经过了脱羟和甘氨酸化反应。

DM10：保留时间为8.69min,[M-H]-的分子离子峰m/z为254.0688，结合原形成分丹参素的分子结构，判断其分子式为C11H13NO6，对其进行MS/MS扫描，产生2个主要碎片离子，碎片m/z=208.0303为母离子失去1个HCOOH得[M-H-HCOOH]-峰，碎片m/z=180.1846为母离子失去1个C2H4NO2得[M-H-C2H4NO2]-峰，推测DM10在体内经过甘氨酸化反应。

CM3：保留时间为2.02min,[M-H]-的分子离子峰m/z为231.0041，结合原形成分川芎嗪的分子结构，判断其分子式为C8H12N2O4S，对其进行MS/MS扫描，产生1个主要碎片离子，碎片m/z=96.9570为母离子失去1个C8H12N2得[M-H-C8H12N2]-峰，碎片m/z=96.9570为硫酸酯基，故推测CM3在体内经过了硫酸酯化反应。

3.6丹参素及川芎嗪在大鼠体内的代谢途径解析

从大鼠的血浆、尿液、粪便、胆汁中共鉴定出13个代谢产物，其中丹参素代谢产物10个、川芎嗪代谢产物3个，涉及体内代谢反应包括脱羟、脱羧、硫酸酯化、甘氨酸化、葡萄糖化、葡萄糖醛酸化以及它们的复合反应等。丹参素和川芎嗪在大鼠体内的主要代谢途径见图8，丹参素和川芎嗪代谢产物的保留时间、分子式和质谱信息见表1。

表1丹参川芎嗪注射液中丹参素和川芎嗪在大鼠体内的代谢产物

图8丹参素和川芎嗪在大鼠体内的主要代谢途径

4、讨论

药物在体内受到代谢酶及体液的作用，从而产生化学结构的转变，称之为药物的代谢[14]。给药后，一部分药物直接以原形吸收入血，另一部分药物经体内代谢转化为代谢产物，但是代谢样品基质环境复杂且浓度低，这些都限制了对代谢产物的研究。而UPLC-Q/TOF-MS技术具有选择性强、灵敏度高、样品前处理简单等优点，并且能获得化合物的保留时间、相对分子质量和特征结构碎片等信息，因此能够在复杂的样品中提取成分并进行定性或定量分析[15,16]。故本实验采用UPLC-Q/TOF-MS技术分析注射丹参川芎嗪注射液后其主要成分丹参素和川芎嗪在大鼠体内的代谢产物。实验过程中收集了血液、尿液、粪便和胆汁等可能含有代谢产物的生物样品，检测时采用正、负离子两种扫描模式对代谢生物样品进行检测，以便尽可能多地检测到样品中的代谢产物。通过检测可以获得代谢产物的保留时间、相对分子质量和特征碎片离子、二级碎片离子信息并结合UNIFI分析平台进行的系统分析，在大鼠血浆、尿液、粪便、胆汁中共鉴定出2个原形成分和13个代谢产物，主要涉及的代谢反应包括脱羟、脱羧、硫酸酯化、甘氨酸化、葡萄糖化、葡萄糖醛酸化以及它们的复合反应等，并且在胆汁中发现了其他文献中尚未报道的丹参素甘氨酸代谢产物。本实验借助高分辨质谱系统，对给药后大鼠代谢样品进行研究，明确了丹参川芎嗪注射液主要成分丹参素和川芎嗪在大鼠体内的代谢产物，为阐明丹参川芎嗪注射液的药效物质基础提供了科学的依据，为更好地了解该制剂在体内的吸收代谢机制提供了参考。

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基金:吉林省省校共建计划专项(No.SXGLSF2017-1-1);吉林省科技发展计划项目(No.20180004).