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梓木草防治COVID-19潜在作用机制的网络药理学研究

2024-11-06 58 上传者：管理员

摘要：目的运用网络药理学方法探讨梓木草治疗新型冠状病毒感染（COVID-19）的潜在作用机制。方法文献检索梓木草的有效成分，通过DisGeNET数据库、GeneCards数据库获取COVID-19靶点；利用韦恩图获取药物-疾病交集靶点并将其导入蛋白互作网络分析数据库（STRING数据库）获取核心靶点，在注释、可视化和综合发现数据库（DAVID数据库）对交集靶点进行基因本体论（GO）分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析，最后利用AutoDock Vina及PyMOL 2.5软件进行分子对接，使用Cytoscape 3.10.0软件进行可视化呈现。结果梓木草中的β-谷甾醇、柯伊利素、木犀草素等成分通过肿瘤坏死因子（TNF）、表皮生长因子受体（EGFR）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)等关键靶点调控缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、Janus激酶（JAK）-信号转导和转录激活因子（STAT）信号等通路，从而发挥防治COVID-19的作用。结论梓木草可能通过多成分、多途径发挥抗COVID-19的作用。

关键词：
COVID-19
中医药
分子对接
梓木草
网络药理学
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新型冠状病毒感染（COVID-19）流行威胁着全球公共卫生安全，重症COVID-19的特征包括炎症综合征、细胞因子风暴、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等[1]。中医与现代医学相结合在防治COVID-19中发挥着重要作用，中医药因其抗病毒活性的经济性、可及性成为治疗COVID-19良好替代方案[2]。然而，中药临床试验集中在经典的中药配方、中成药等方面[3]，中医药特有的临床价值与原有的科技资源潜力仍需进一步挖掘。

梓木草（Lithospermum zollingeri A.DC）是紫草属植物，全草及果实均可供药用，可用于止痛、支气管炎等症。网络药理学可以揭示中医药多途径、多靶点、多成分的综合整体效应[4]。本研究运用网络药理学方法探讨梓木草防治COVID-19的潜在作用机制，为梓木草药用价值提供依据。

1、资料与方法

1.1药物靶点预测

通过中国知网、万方数据库、PubMed等网站检索梓木草的活性成分。使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP)2.3数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找成分结构式，使用Swiss TargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetpredic⁃tion.ch/）获取相关人类靶点。

表1梓木草的化学成分

注：ID为成分自命名；PubChem Cid为梓木草成分在PubChem数据库中的ID。

1.2药物-疾病靶点的获取

在DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.org/）、GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）获取COVID-19疾病基因，将药物靶点和疾病靶点作交互式韦恩图，获取药物-疾病交集靶点，利用Cytoscape 3.10.0软件预测关键活性成分。

1.3蛋白互作网络（PPI）的构建

将交集靶点基因导入PPI分析数据库（STRING) 11.5数据库（https：//cn.string-db.org/），物种选择“Homo sapiens”，参数Interac⁃tion score设定为0.40，获取网络结果并导入Cytoscape3.10.0软件，借助Cyto Hubba功能以“degree”进行排序预测核心靶点。

1.4富集分析

提取交集基因在注释、可视化和综合发现数据库（DAVID）数据库（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）中进行基因本体论（Gene ontology,GO）功能分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclope⁃dia of genes and genomes,KEGG）分析，获得靶点基因在体内可能涉及的细胞组分（Cellular component,CC）、参与的分子功能（Molecular function,MF）、生物学过程（Biological process,BP）；以P<0.05为筛选标准，分析梓木草抗COVID-19的主要信号通路及生物过程。利用Cytoscape 3.10.0软件绘制GO-KEGG-成分-靶点网络图。

1.5成分靶点分子对接

在UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）获取核心靶点ID，以其为受体在蛋白质结构数据库（PDB)(https：//www.rcsb.org/）中获取对应3D结构；以梓木草9种成分为配体，在PubChem数据库获取对应3D结构；通过AutoDock Vina 1.1.2进行分子对接，用PyMOL 2.5软件进行可视化呈现。

2、结果

2.1梓木草成分靶点筛选

以“Lithospermum Zollingeri A.DC”“梓木草”作为关键词进行检索，得到梓木草的主要成分为芹菜素、木犀草素、刺槐素等（见表1），获取梓木草成分的人类靶点共121个。

2.2 COVID-19的核心靶点获取及药物-疾病靶点

以“COVID-19”“SARS-COV-2”“Coronavirus Infections”为检索词在DisGeNET、GeneCards数据库检索相关靶点，最终纳入1655个靶点。构建药物-疾病韦恩图，获得24个共同靶点。Cytoscape 3.10.0软件Cyto Hubba插件运算药物-疾病网络提示β-谷甾醇、柯伊利素、木犀草素交互较多。

2.3梓木草抗COVID-19的核心靶点筛选

将共同靶点导入STRING数据库，获取PPI数据。将结果导入Cyto⁃scape 3.10.0软件使用Cyto Hubba插件进行运算，获取de⁃gree前10核心靶点，包括肿瘤坏死因子（TNF）、表皮生长因子受体（EGFR）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG）、信号传导及转录激活蛋白3(STAT3）、白细胞介素2(IL-2）、BCL2L1、雌激素受体1(ESR1）、聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶1(PARP1）、蛋白激酶Cα(PRKCA）、雄激素受体（AR）。

2.4 GO和KEGG富集分析

将共同靶基因导入DAVID数据库进行富集分析，通过GO分析筛选出BP条目79条，包括RNA聚合酶Ⅱ启动子对pri-miRNA转录的正调控、转录的正调控/DNA模板化、基因表达的负调控等；筛选出CC条目16条，包括胞浆、细胞质、细胞核等；筛选出MF条目29条，包括RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性/配体激活序列特异性DNA结合、酶结合、相同的蛋白质结合等。

KEGG分析筛选出信号通路有65条，包括缺氧诱导因子-1(HIF-1）信号通路、Janus激酶（JAK）-信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路、COVID-19等，梓木草成分抗COVID-19作用可能与病毒感染信号通路、炎症信号通路等通路相关。

提取P值，按照从小到大的原则对BP、CC、MF的前10条目及KEGG分析结果的前20条通路的活性成分、关键靶进行点排序，利用Cytoscape 3.10.0软件构建GO-KEGG-成分-靶点网络图，见图1。

2.5分子对接结果

选用核心靶点TNF、EGFR、PPARG，在PDB数据库中提取对应人类结构蛋白ID:5M2J、1M17、8B8W，分别与梓木草9种成分进行分子对接，分子对接热能见表2。结果显示尿囊素、尿嘧啶的结合能大于-5 kcal/mol，其余7种成分结合能均小于-7 kcal/mol，对接形成的结构较稳定。以结合能较低生成氢键更好的陈皮苷-8B8W、木犀草素-1M17进行展示。见图2。

图1 GO-KEGG-成分-靶点网络图

注：按照从外向内的顺序，第1圈▽为KEGG分析结果；第2圈为GO分析结果：▽为MF，△为BP，◇为CC；第3圈为核心靶点；第4圈○为活性成分。

表2梓木草成分与靶点蛋白分子对接结合能

(kcal/mol)

3、讨论

COVID-19是严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2）感染所致的一种多症状多器官受损的疾病。目前，COVID-19治疗方案主要集中在抗病毒药物、JAK抑制剂和类固醇等[1]。中医药发挥了积极的作用，如连花清瘟可在mRNA水平上显著降低促炎细胞因子（TNF-α、IL-6）的产生，发挥抗炎活性[5]。

梓木草抗COVID-19相关活性成分较主要的是β-谷甾醇、柯伊利素、木犀草素等。β-谷甾醇是植物雌激素，具有抗流感的作用[6]，通过抑制炎症改善哮喘症状[7]。柯伊利素是一种黄酮类化合物，是葡萄叶提取物抗SARS-CoV-2活性成分之一[8],SARS-CoV-2主要靶点与柯伊利素具有较好的结合自由能[9]。含木犀草素药物在COVID-19导致的长期嗅觉功能异常患者中疗效更好[10]。

PPI分析显示，关键靶点为TNF、EGFR、PPARG等。在重症COVID-19中，SARS-CoV-2参与的模式识别受体（PRR）和环化5'-鸟苷酸二钠（GMP）-单磷酸腺苷（AMP）合成酶（cGAS-STING）信号转导会诱导TNF、IL-6等促炎细胞因子表达[11]。TNF介导的炎症可引起组织损伤并逐渐促进肺纤维化，进而导致肺炎、肺水肿和急性呼吸窘迫综合征等[12]。阻断EGFR信号可作为COVID-19的靶向治疗[13]。PPAR具有免疫调节作用，使用相关配体激活PPAR与减少炎症风暴、降低COVID-19严重程度有关[14]。PPAR激动剂可作为COVID-19疫苗的辅助剂[15]。

图2药物-靶点蛋白分子对接图

KEGG富集结果显示，梓木草防治COVID-19感染与HIF-1信号通路、JAK-STAT信号通路等相关。抑制HIF-1信号传导可以减少COVID-19引起的炎症性肺损伤的程度[16]。JAK/STAT信号转导直接参与ARDS的进展或与其他途径联合加重ARDS的进程，JAK抑制剂治疗COVID-19诱导的ARDS的临床试验显示出积极的效果[1,17]。

综上所述，梓木草可能是通过多组分、多靶点、多途径发挥防治COVID-19的作用，本研究为梓木草后续深入研究奠定了循证依据，其相关作用仍需体内外试验进一步验证。

参考文献:

[4]庄延双,蔡宝昌,张自力.网络药理学在中药研究中的应用进展[J].南京中医药大学学报,2021,37(1):156-160.

基金资助:怀化市第二人民医院科技项目【No.2023YP007】;

文章来源:龙文明,向春红,罗满云,等.梓木草防治COVID-19潜在作用机制的网络药理学研究[J].中国中医药现代远程教育,2024,22(22):170-173.