关节假体周围感染(periprostheticjointinfection,PJI)是人工关节置换最具灾难性的术后并发症，始终困扰着关节骨科的医生们[1,2]。一旦术后发生PJI，治疗难度明显增加，不仅如此，患者也将面临住院时间延长、承受更大的经济压力等困境。

PJI的发生率虽然不高，在初次全髋、膝关节置换术后发病率分别为1%-2%及2%-3%[3]，但是随着人口老龄化的加速，人工关节置换的数量逐年上升，同时PJI的发生也随之增加。因此，近年来PJI的治疗引发关节骨科医生们的广泛关注。目前，PJI的常规治疗一般包括抗生素控制感染、一期翻修、二期翻修(间隔器置入)[4]。然而，现代治疗存在着长期使用抗生素导致细(真)菌耐药，外科手术翻修费用超高，一般经济条件的家庭难以负担等问题[1]。

五味消毒饮源于吴谦的《医宗金鉴》，为治疗外科疮痈疔毒之要方，由金银花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子5味清热药组成，具有清热解毒、凉血消肿之功。现代药理研究表明，五味消毒饮具有广谱的抗菌作用，抑制细菌生物膜的形成，使细菌对抗菌药物的敏感性增强[5]。另外，多项研究表明五味消毒饮对人工关节置换术后PJI具有良好控制及预防作用[6,7]。但因此方中药成分较多，中药功能主治广泛，多通路与多靶点相互作用关系网络错综复杂等因素，其作用机制尚不明确。

此次研究利用有效化合物、基因靶点等数据库，通过现代中药网络药理学构建复方-中药有效成分-靶点基因-PJI疾病共表达网络，并对交集基因进行富集分析，从而揭示五味消毒饮对PJI疾病作用的有效化合物及机制，为其临床应用及后期的实验研究提供理论依据。

1、资料和方法

1.1 设计

生物信息学实验。

1.2 时间及地点

于2019年12月至2020年1月在广州中医药大学完成。

1.3 材料

五味消毒饮由金银花、蒲公英、野菊花、紫花地丁、紫背天葵子5味中药组成。

1.4 方法

1.4.1 五味消毒饮的活性化合物及其作用靶点预测

首先采用中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM,http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)来预测五味消毒饮的作用靶点。BATMAN-TCM平台是第一个专门为研究中药分子机制而设计的在线生物信息学分析工具，它通过“药物相似性分数”的原理进行靶点预测，药物相似性分数指利用解剖-治疗-化学的药物分类系统、药物的不良反应，化合物相互作用计分的相似度，蛋白互作网络中心趋向性，功能富集相似度等计算得出各类相似分数，并通过LODO法(Leave-one-drug-out)对预测进行验证，确保预测更为精确。将此次研究中五味消毒饮中的5味中药分别输入大写拼音至BATMAN-TCM数据库中，并将预测靶点基因的条件设置为默认值，得出5味中药的化合物成分及其预测的靶标基因。

1.4.2 PJI的疾病靶点检索

以“PeriprostheticJointInfection”的检索词，在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)2个在线数据库中进行PJI的已知相关疾病靶点检索，检索日期至2020年1月截止。汇总去重2个数据库检索出的疾病靶点从而得到PJI疾病靶点。

1.4.3 WWXDY-PJI疾病交集靶点基因相互作用网络的构建及核心基因筛选

获取五味消毒饮相关预测作用靶点和PJI已知疾病靶点后，R语言运行脚本取两者靶点基因重叠交集，将交集基因导入STRING在线数据库(http://string-db.org/)进行蛋白相互作用网络的构建。通过R语言运行脚本分析计算每个靶点基因的邻接基因数目(即靶点基因之间相互作用的连线数目，又称度值)并采用Excel作条状图以直观显示，根据大于平均度值筛选获得核心靶点。

1.4.4 WWXDY-靶点-PJI疾病调控网络构建

为了更加清晰地理解五味消毒饮治疗PJI的作用机制，将上述3步构建的“WWXDY-靶点-PJI”的靶点数据库，导入Cytoscape3.7.2(http://www.cytoscape.org)软件进行五味消毒饮治疗PJI疾病可视化调控网络模型的构建，其中结构关系为“WWXDY-5味中药-有效化合物-靶点-PJI”。

1.4.5 基因本体论(GeneOntology,GO)分析

GO分析是一个在生物信息学领域中广泛运用的系统，它包括生物学的3个方面：细胞组分、分子功能、生物过程。DAVID数据库是一个集生物功能注释、网络可视化和集成发现于一身的多功能生物信息数据库。此次研究采用DAVID分析工具(https：//david.ncifcrf.gov/)对WWXDY-PJI疾病交集靶点基因进行GO富集分析，根据统计学超几何分布定量(P值)评价存在于各GO注释中的蛋白质群，以P值反映蛋白质生物学功能的显著性。将物种与背景设置为“Homosapiens”(人类)，设定P<0.01，得到WWXDY治疗PJI的生物过程、分子功能、细胞组分结果。采用imageGP在线作图工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/)制作GO分析结果气泡图。

1.4.6 KEGG通路富集分析

算法原理与GO富集分析相同，应用DAVID工具对WWXDY-PJI疾病交集靶点基因进行京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)通路分析(设定P<0.01)，将物种与背景设置为“Homosapiens”(人类)，得到五味消毒饮治疗PJI的主要作用通路，对显著性排名前十的通路进行分析，采用imageGP在线作图工具制作KEGG通路气泡图，采用Cytoscape3.7.2构建通路-靶点基因网络图。

2、结果

2.1 WWXDY有效化合物、作用靶点及PJI疾病靶点的预测结果

通过BATMAN-TCM平台检索总共预测到五味消毒饮的有效化合物37个，其中金银花24个，蒲公英6个，野菊花7个，紫花地丁1个，紫背天葵子1个。随后获得其作用靶点共914个，通过GeneCards和OMIM数据库共筛选获得PJI的疾病靶点共286个。取两者靶点的交集，最终获得WWXDY-PJI疾病交集靶点共39个，见图1。

图1五味消毒饮和关节假体周围感染疾病的交集靶点基因图

2.2 WWXDY-PJI疾病交集靶点基因相互作用可视化网络及核心基因筛选结果

利用STRING在线数据库构建了交集靶点基因蛋白相互作用网络，结果见图2。蛋白相互作用网络包含39个蛋白质节点，277条相互作用关系，即节点间的连接线，其中2个蛋白质节点无相互作用关系(已剔除)，平均度值(degree)为14.2，平均局部聚类系数(avg.localclusteringcoefficient)为0.741。根据大于平均度值筛选获得16个核心靶点基因，见图3所示，其中大于2倍平均度值的靶点分别为白细胞介素6、肿瘤坏死因子、白细胞介素1β。

图2交集基因的蛋白相互作用网络图(PPI网络)

2.3 WWXDY-靶点-PJI疾病可视化调控网络

采用Cytoscape3.7.2软件构建的WWXDY-靶点-PJI疾病可视化调控网络见图4，图中清晰可见五味消毒饮中5味中药与有效化合物、有效化合物与交集靶点基因、靶点基因与PJI疾病之间分别的对应关系。靶点所连接的化合物越多，说明度值越大，该靶点就越重要。网络中，左边四边形39个节点为靶点基因，右边椭圆形37个节点为有效化合物。错综复杂的“边”(连线)，体现了五味消毒饮多种有效化合物，多条途径作用于靶点基因。

图3核心靶点基因

图4WWXDY-靶点-关节假体周围感染疾病可视化调控网络

2.4 交集基因的GO富集分析结果

将交集靶点基因输入DAVID在线工具后，获得按P值升序排列的50个功能富集，其中包括生物过程40个，分子功能5个，细胞组分5个。选取排名前10位的生物过程、所有分子功能、所有细胞组分制成表格，见表1，并以气泡图的形式直观展示，见图5。GO富集分析结果显示，WWXDY-PJI疾病交集靶基因的生物过程主要是趋化因子生物合成过程的正向调控、蛋白激酶B信号、炎症反应、寄主共生生长的负调控、中性粒细胞趋化性、ERK1和ERK2级联的正调控、内皮细胞凋亡过程的负调控、脂多糖媒介的信号通路、体外凋亡信号通路、细胞因子分泌的负调控参与免疫应答等；分子功能为细胞因子活性、生长因子活性、ICAM-3受体活性、Ⅲ型转化生长因子受体结合、前列腺素-内过氧化物合酶活性；细胞组分为细胞外空间、细胞表面、细胞膜外侧面、胞外区、整合蛋白αL-β2复合体。

2.5 交集基因的KEGG富集分析结果

与GO富集分析相同，WWXDY-PJI疾病交集靶基因的KEGG富集分析结果见表2，其主要涉及类风湿性关节炎、疟疾、细胞因子-细胞因子受体相互作用、南美锥虫病、利什曼病、炎症性肠病、阿米巴病、肿瘤坏死因子信号通路、肺结核、自然杀伤细胞介导的细胞毒性等信号通路见图6。信号通路与靶点基因相互关系见图7。

图5基因本体论功能(GO)富集分析图

图6京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集信号通路

图7京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路与靶点基因相互关系网络图

表1五味消毒饮-关节假体周围感染疾病交集靶点基因的GO富集分析结果

表2五味消毒饮-关节假体周围感染疾病交集靶点基因的京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析结果

3、讨论

PJI是人工关节置换术后最可怕的并发症，其治疗对于临床医生而言是一个巨大的挑战，目前尚且没有能够根治该疾病的办法。其致病菌主要以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌多见[8],PJI的难治性在于细菌会在人工关节假体表面形成生物膜，生物膜是由细菌分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖类物质，生物膜形成后能够对菌群形成包裹保护作用，使抗生素无法发挥抗菌作用[9]。

PJI在中医中归属于“附骨疽”的范畴，其中医病机为手术所致邪毒入侵，侵于筋骨，导致邪毒壅滞，气血博结，血凝毒聚，聚而化热，热毒凝结，气血经络阻塞，以致脓腐疮痈渗于肌肤，甚则流于体表[7]。五味消毒饮为历代医家所崇尚治疗具有热毒证的外科感染性疾病的代表方剂，具有清热解毒、凉血消肿之功，主治疔疮肿毒、痈疡疮疖等。方中金银花、野菊花，清热解毒散结，金银花入肺胃，野菊花入肝经，二药相配共解中、上焦之热；蒲公英、紫花地丁均具清热解毒之功，为痈疮疔毒之要药；蒲公英兼能利水通淋，泻下焦之湿热，与紫花地丁相配，善治一切感染性炎症；紫背天葵入三焦，善除三焦之火。诸药合用，能够抑制炎症进展，达到抗菌，控制感染的目的[10,11]。PJI疾病的临床表现为手术切口部位红、肿、热、痛，窦口窦道形成，渗出流脓明显，为一派热毒证候，正是五味消毒饮的主治范畴。

此次研究利用网络药理学突破单基因靶点思路的约束，从多基因靶点的方向进行整体分析的优势，通过数据库筛选出五味消毒饮中香芹酚、法尼醇、蒎烯、棕榈酸甲酯、岛藤碱、正己醇、苯乙醛、松油醇、甲基丁酸等37个有效化合物，五味消毒饮与PJI疾病的39个交集基因，构建了WWXDY-有效化合物-靶点-PJI疾病可视化调控网络，并进行交集基因的GO和KEGG富集分析，预测分析了WWXDY治疗PJI的可能作用机制。

根据大于平均度值筛选获得的16个核心靶点基因中，大于2倍平均度值的靶点依次为白细胞介素6、肿瘤坏死因子和白细胞介素1β，由此可见，白细胞介素6是最重要的靶点，白细胞介素6、白细胞介素1β和肿瘤坏死因子均属于促炎细胞因子。研究表明，在PJI患者中血清白细胞介素6的敏感性与C-反应蛋白相似，可作为临床诊断PJI的参考指标，能够刺激巨噬细胞的抗菌活性[12]，不仅如此，白细胞介素6还可促进破骨细胞分化，抑制成骨细胞分化和成骨细胞外基质矿化，在促进感染和炎性反应的同时，加速假体周围骨质的吸收溶解[13]。白细胞介素1β是白细胞介素1的一种亚型，在宿主防御感染的背景下发挥着广泛的炎症活性[14]。研究表明，携带特定白细胞介素1β基因型(单倍型)的个体在对感染或炎症刺激反应中产生的白细胞介素1β蛋白有很大的不同，编码细胞因子白细胞介素1β的基因的功能性等位基因变异可能使全关节置换术后患者发生PJI的易感性增加[15]。肿瘤坏死因子是由活化的巨噬细胞和淋巴细胞表达，可以诱导多种细胞反应，一些细菌蛋白可激活核因子κB从而上调抗凋亡基因抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡，或诱导肿瘤坏死因子产生以增强细胞凋亡，此外细菌还可以使用宿主肿瘤坏死因子受体介导致病性[16]。

通过图4中的WWXDY-靶点-PJI疾病可视化调控网络结果显示，五味消毒饮中五味中药的37个有效化合物可分别作用于不同的靶点，而同一靶点(如白细胞介素6)也可与多个中药有效化合物发生逆向联系作用。这表明五味消毒饮是通过多种通路、多种靶点、多种方式作用于PJI疾病的，而并非传统观念上的药物单一靶点、单一途径起作用；另外，五味消毒饮的有效成分之间相互协同、相互促进。

通过GO富集分析，如表1所示，生物过程中趋化因子生物合成过程正向调控的显著性居于首位。趋化因子是一类能够通过形成浓度梯度和与细胞表面的趋化因子受体相互作用来趋化细胞定向移动的可溶性信号蛋白[17]，当组织细胞和免疫细胞在受到刺激物如生长因子、干扰素、病毒产物及细菌产物的诱导时可分泌出不同的趋化因子。趋化因子及其受体的趋化功能对于组织发育、炎症和转移至关重要，是目前治疗炎症性疾病十分有前景的靶点[18]。

研究表明，阻断某一趋化因子能够抑制炎症反应[19,20]，此次研究中五味消毒饮可能通过阻断趋化因子从而对PJI产生抗菌作用。此外，蛋白激酶B信号、炎症反应、脂多糖媒介的信号通路、细胞因子分泌的负调控参与免疫应答均与感染性炎症疾病密切相关；其中蛋白激酶B信号可通过其下游的转录因子如SIRT1抑制炎症因子表达[21]；脂多糖是革兰阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是由脂质和多糖构成的糖脂质，许多PJI由革兰阴性细菌感染所引起[22]；细胞因子是主要由免疫细胞所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，具有参与炎症反应的作用，部分细胞因子(如血清白细胞介素6)在诊断PJI上大有帮助[23]。

分子功能中，细胞因子活性、ICAM-3受体活性、前列腺素-内过氧化物合酶活性均通过不同的作用方式参与感染性炎症过程。其中显著性最高的细胞因子活性具有抗感染，促进炎症过程等生物学作用，手术部位受到病菌入侵后，免疫系统激活，白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等细胞因子促进炎症细胞的聚集、活化和炎症介质的释放[24]。这些生物学过程均或多或少地通过白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等靶点参与对PJI地调控，与由细菌或真菌形成生物膜致病的PJI疾病密切相关。目前来说，有关于白细胞介素6、白细胞介素1β以及肿瘤坏死因子α作为诊断PJI血清标志物的研究较多，与作者预测的结果具有一致性。

通过KEGG通路分析，如表2所示，五味消毒饮主要通过炎症感染相关、细胞因子、免疫细胞因子介导等信号通路作用于PJI疾病。炎症感染相关通路包括类风湿性关节炎、疟疾、南美锥虫病、利什曼病、炎症性肠病、阿米巴病、肺结核，细胞因子通路包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路，免疫细胞介导的相关通路包括自然杀伤细胞介导的细胞毒性。炎症相关通路中，类风湿性关节炎是一种与炎症反应密切相关的自身免疫性疾病，其信号通路复杂，与炎症相关的有p38MAPK、CD4+Th细胞等信号通路。研究发现，抑制p38MAPK酶活性可减少多种炎性递质的生成，从而减轻炎症反应[25]；自然杀伤细胞可直接激活CD4+Th细胞使其分泌γ-干扰素，而γ-干扰素又可激活抗原递呈细胞，发挥促炎作用[26]。

疟疾是一种涉及多个寄生虫阶段和宿主的系统性疾病，并导致大量免疫细胞的活化和炎性介质的释放，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素3等多种细胞因子[27]，与感染性疾病PJI相关。皮肤利什曼病免疫发病机制的主要标志是CD8+T细胞介导的细胞毒活性，研究首次证实利什曼病患者表现出循环自然杀伤细胞的积累，与对照组相比，表现出更高的细胞毒性和炎症潜力[28]。锥虫是拉丁美洲南美锥虫病的病原体，在昆虫(包括锥虫)中，微生物攻击后免疫系统的激活可以通过信号途径(如免疫缺陷和Toll)来控制，以抵抗感染，这些激活的途径向下游的核因子κB组织因子发出信号，以刺激特定的免疫基因，从而触发了效应分子例如抗菌肽的合成；研究表明了核因子κB组织因子在抑制细菌和寄生虫感染的先天免疫应答中的重要性[29]，因此，南美锥虫病信号通路与PJI疾病作用机制紧密贴切。炎症性肠病中，白细胞介素21与γ-干扰素协同作用以优化表达受干扰素刺激的基因，并增强对肠道微生物感染的保护作用[30]。阿米巴病是一种由溶组织性变形杆菌引起的寄生虫病[31]，肺结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，与PJI疾病相似。细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路中，细胞因子常结合其受体介导细胞间的相互作用，具有调节免疫应答、参与炎症反应等作用，上述GO分析中已说明。肿瘤坏死因子因其在抗感染中至关重要的作用而被广泛研究，其关键作用之一是在控制侵入性感染同时促进细胞间通讯。越来越多的证据表明，抑制肿瘤坏死因子与严重的感染性疾病相关联。继发于感染的临床症状不仅由来自入侵生物体的毒素引导，而且由感染触发的宿主介质——肿瘤坏死因子所引导[32,33]。免疫细胞因子介导的相关信号通路中，自然杀伤细胞是自然免疫系统的重要组成部分，能够对病毒、寄生虫和细菌感染做出早期的宿主反应，目前自然杀伤细胞已被证明能够抗感染；自然杀伤细胞控制这些感染的机制或许是通过细胞毒性机制或细胞因子介导直接作用于受感染的细胞或通过调节免疫系统功能和改变特异性免疫反应的性质[34]。

综上所述，此次研究通过网络药理学分析得出的结果表明，五味消毒饮治疗PJI疾病的可能机制是通过调控白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子、自然杀伤细胞、脂多糖等，从而抑制病原菌生长，抑制生物膜形成，调控相关炎症反应。其治疗过程存在着多个有效化合物、作用途径以及靶点基因，侧面体现了中医防治疾病的整体观念和辨证论治思想，为治疗PJI提供了新思路、新方向，也为更进一步了解中药复方治疗PJI疾病的作用机制提供了新参考。然而，此次研究只是对作用机制的预测探讨，具体的分子机制还需要后续的实验进一步验证。

参考文献：

[5]黄水仙,田道法.五味消毒饮临床应用研究进展[J].湖南中医药导报,2002,8(9):523-525,529.

[6]李兆合.五味消毒饮治疗关节置换术后金黄色葡萄球菌感染机理窥探[J].中医学报,2012,27(5):613-614.

[7]赵辉.五味消毒饮加减预防全髋关节置换术后感染疗效观察[J].山东中医杂志,2015,34(3):187,195.

[10]杨晓琴,吴亿晗,白俊毅,等.五味消毒饮口服液HPLC指纹图谱的建立及6种指标性成分定量测定[J].中草药,2017,48(24):5151-5157.

[11]王大忠,孙永强,包伟东.清创后普朗特液体敷料浸泡联合负压封闭引流和五味消毒饮内服治疗人工髋膝关节置换术后假体周围急性感染[J].中医正骨,2016,28(9):52-54.

[24]顾云,庄重.炎症反射研究新进展[J].中国病理生理杂志,2016,32(12):2300-2304.

张海涛,辛鹏飞,冯文俊,曹厚然,陈锦伦,邓鹏,揭珂,葛颖杰,彭鑫玉,李杰,曾建春,曾意荣.基于网络药理学分析五味消毒饮治疗关节假体周围感染的作用机制[J].中国组织工程研究,2020,24(36):5843-5849.