膝骨关节炎是一种骨科常见的以膝关节肿胀疼痛、活动僵硬或伴有弹响、上下楼梯疼痛加重休息后症状缓解为主要特征的退行性疾病，发病人群常见于老年人。随着病情的发展，关节会逐渐出现疼痛、畸形及功能受限，可单侧发病，也可双侧发病。X射线片常表现为关节间隙狭窄、边缘有骨刺和骨赘形成、后期骨端变形、关节面硬化、髁间隆起高尖、甚至关节内软骨剥落形成关节内游离体[1]，致残率可达53%[2]。流行病学调查显示，中国60岁以上的人群达50%，而在70岁以上人群中有将近80%患有膝关节骨关节炎，40岁以上人群发病率大于40%，女性群体居多[3]。然而目前尚无根治骨关节炎的理想药物，临床上常用的是非类固醇类药物(NSAIDS)，主要是消炎止痛对症处理，但存在上消化道刺激、出血等不良反应。

膝骨关节炎属祖国医学“骨痹”“膝痹病”范畴，其病机主要是年老体衰，肝肾不足、气血亏虚，膝为筋之府，血不荣筋，则腰膝酸软无力，外加风寒湿邪乘虚而入，筋络失于温煦，导致气血痹阻不通，不通则痛，即见疼痛等症。中医药在防治膝痹病方面具有较好的疗效，特别是一些常用药对，使用频率较高，效果较为确切。

在一项运用中医传承辅助平台V2.5软件的研究中发现[4]，“乳香-没药”是方剂中用于治疗膝骨关节炎频率最高的药对。据国家药典(2015版)记载，乳香与没药二者皆归肝、心、脾经，都具有活血散瘀定痛的功效，主治症见风湿痹痛、跌打损伤、经络瘀阻等疾病，广泛应用于临床配伍治疗膝骨关节炎且疗效显著，但其药理作用机制尚未完全明确。

网络药理学是基于系统生物学融合多学科形成发展的一种新学科，为预测药物作用于疾病的关键靶点和生物系统的网络分析提供了可靠的研究平台[5,6]。该研究借助网络药理学全面性、系统性的特点深入挖掘“乳香-没药”治疗膝骨关节炎的关键靶点和可能作用机制，以期为今后临床治疗用药提供思路和参考。

1、资料和方法

1.1 软件与数据库

该研究主要采用Cytoscape3.5.1软件及插件构建网络可视化图和数据分析，主要使用数据库包括：中药系统药理学数据库TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、疾病及其相关基因的信息数据库Gene-Cards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、蛋白质数据库Uniport(http://www.uniprot.org/)、蛋白网络互作分析数据库STRING11.0(https://string-db.org/)、交集靶点在线处理系统Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)和富集分析数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)等。

1.2 药物的主要化学成分整理、活性成分筛选及药物靶点的确定

该研究运用TCMSP数据库，根据药物口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%、类药性指数(drug-likeindex,DL)≥0.18初步检索筛选中药乳香和没药的化学成分，时间截止至2020年3月。对筛选出来的化合物进行核查，最终利用有效活性化合物的结果查找药物靶点。最后采用Uniport在线数据库对蛋白靶点数据进行标准化。

1.3 疾病相关靶点的筛选和药物-疾病共同靶点确定

通过GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank数据库以“KneeOsteoarthritis”为关键词检索收集膝骨关节炎疾病相关的基因。为明确疾病相关靶点与“乳香-没药”潜在靶点之间的相互作用，将疾病靶点与药物靶点进行交集。将疾病靶点与药物成分靶点分别输入Venny2.1软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图。

1.4 “药物-靶点-疾病”相互作用网络的构建

将在韦恩图中筛选得到的疾病-药物的共同靶点输入STRING10.5平台(https://string-db.org/)，蛋白种类设置为“Homosapiens”，最低相互作用阈值设为中等“highestconfidence”(>0.9)，隐藏离散点，其他参数保持默认设置，构建蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteraction,PPI)网络模型，获得PPI网络。然后运用Cytoscape3.5.1软件构建“乳香-没药”活性成分-靶点和膝骨关节炎疾病-靶点的可视化网络图。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用DAVID工具(https://david.ncifcrf.gov/)进行富集分析，通过统计学超几何分布定量(P值)评估存在于各GO注释中的蛋白质群[7]，以P值反映蛋白质生物学功能的显著性。应用DAVID工具对药物-疾病交集蛋白靶标基因进行KEGG通路富集分析[8]，得到“乳香-没药”治疗膝骨关节炎的主要作用通路。该研究将获得的“乳香-没药”与膝骨关节炎疾病共有的关键靶点蛋白进行功能注释和富集分析，探讨其治疗膝骨关节炎的作用靶点及相关信号通路。

2、结果

2.1 乳香-没药活性成分筛选与对应靶蛋白信息

运用TCMSP数据库共初步检索到已知的乳香活性成分127个、没药276个，其中乳香符合口服生物利用度、类药性指数筛选条件的生物活性成分8个，没药45个，最终得到53个有效生物活性成分，见表1。

2.2 乳香-没药-活性成分-靶点网络构建及关键靶点获取

检索53个有效活性成分并通过转换后获得“乳香-没药”作用靶点412个。通过GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank数据库共收集膝骨关节炎的相关靶点1894个，汇总去重后共得到膝骨关节炎疾病相关靶点1889个。构建中药-活性成分-靶点可视化网络图，并将药物预测靶点与疾病靶点进行映射后获得“乳香-没药”药物与膝骨关节炎共有靶点105个，绘制的韦恩图见图1。通过Uniprot(http://www.uniprot.org/)在线数据库将预测出的靶点名称标准化并构建成分-靶点和疾病-靶点的可视化网络图，见图2。

表1|“乳香-没药”主要有效生物活性成分(口服生物利用度值前20位)

2.3 靶点蛋白与蛋白互作网络分析

将获得的108个共有靶点上传至在线STRING11.0数据库(https://string-db.org/)，设置最高置信度蛋白质参数评分值>0.7，获取相应的蛋白相互作用信息，获得关键靶点蛋白105个，见图3，根据Count值筛选列举“乳香-没药”治疗膝骨关节炎排名前30的关键靶点，见表2。

2.4 “乳香-没药”治疗膝骨关节炎基因GO富集分析

利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)和Cytoscape3.5.1软件功能对“乳香-没药”药对与膝骨关节炎的关键靶点进行功能富集分析。在GO富集分析中确定了66个GO条目，涉及到生物合成过程的调控、细胞受刺激的反应、细胞周期调控、转录因子活性、细胞因子活性等各方面。生物学功能注释排名靠前的条目主要是细胞对缺氧的反应、血管生成负调控、上皮细胞增殖的负调控、免疫反应、胰岛素刺激的细胞反应、成纤维细胞增殖的正调控等列举了前20个条目，见表3，图4。

2.5 “乳香-没药”治疗膝骨关节炎基因KEGG富集分析

KEGG信号通路分析确定了95条相关信号通路，主要涉及到炎症、代谢、衰老等方面，富集排名靠前的通路主要有背腹轴形成(Dorso-ventralaxisformation)、Hippo信号通路(Hipposignalingpathway)、心肌细胞肾上腺素能信号(Adrenergicsignalingincardiomyocytes)、哮喘(Asthma)、多巴胺能突触(Dopaminergicsynapse)、AMPK信号通路(AMPKsignalingpathway)等，列举了前20个富集分析结果，见表4(P<0.01)、图5，其中排名第一、二的背腹轴形成(Dorso-ventralaxisformation)和Hippo信号通路(Hipposignalingpathway)富集分析结果，见图6,7。

表2|“乳香-没药”治疗膝骨关节炎STRING网络关键靶点(排名前30)

表4|“乳香-没药”治疗膝骨关节炎关键靶点KEGG分析(排名前20位)

表3|“乳香-没药”治疗膝骨关节炎关键靶点GO分析(排名前20位)

3、讨论

膝骨关节炎临床治疗方法有很多种，对轻、中度膝骨关节炎患者以保守治疗为主，如佩带护膝、中药外敷和口服药物治疗等[9]；症状较为严重者可予以理疗或关节腔内注射透明质酸钠等药物治疗。而对于伴有行走困难、膝部肿胀变形的重度膝骨关节炎人群，膝关节人工置换术是一种重要的治疗方式。但关节严重畸形患者术中操作有一定的技巧和难度[10]。膝骨关节炎主要发病群体为60岁以上的中老年人[11]，对于一些同时患有其他基础疾病的患者，手术治疗会增加危及患者生命安全的风险。而大多数患者会选择长期口服氨基葡萄糖类药物保护软骨或者非类固醇类抗炎药物缓解疼痛[12]，这对于已服用多种治疗其他基础疾病药物的老年人来说，会加重肾脏功能的损害以及胃肠道的刺激。与现代医学相比，中医药治疗膝骨性关节炎有疗效可靠、毒副作用小等独特的优势，并且在祖国医学大量的典籍中对膝骨关节炎的防治有着丰富的记载，现代临床在古人理论经验的基础上加以应用与发挥，使得对该病的认识和治疗不断深入和发展[13]。

膝骨性关节炎属中医学中“骨痹”“鹤膝风”“历节”等范畴[14]，《黄帝内经》曰：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹”。病位虽在筋骨，却与肝、肾两脏关系密切，“肾主骨，肝主筋”。病机主要是由于肝肾亏虚、筋骨失养或风寒湿等外邪侵袭，致患者下肢膝部血瘀气滞或寒湿凝滞，属本虚标实证。“肝肾亏虚”是此病发病的病理基础；“气滞血瘀”是本病发展过程中重要病理环节；“风寒湿”是常见的致病或诱发因素[15]。《素问·长刺节论》：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹”。综上所述，年老体虚，肝肾亏损，气血不足，营卫虚弱，不能抵抗寒湿之邪侵袭，使气血凝涩不行，壅滞不通，血不荣筋，所以造成关节疼痛，屈伸不利，筋骨酸软无力等症状，且久痛多虚，久痛多瘀，久痛入络，久必及肾[16]，故在治疗上需于消肿止痛的基础上，宜用活血行气、祛风散淤、益肾培本之品，庶可奏效。

高欢欢等[4]运用中医传承辅助平台V2.5软件分析古代文献与现代临床治疗膝骨关节炎的数据，发现用药频次排名前5的依次为当归(75次)、乳香(55次)、红花(53次)、没药(51次)、牛膝(49次)，常用药材组合出现频率排名前5的依次为没药-乳香、乳香-当归、当归-羌活、牛膝-当归、川芎-当归。由此研究统计膝骨关节炎用药频次中可以看出，临床用于治疗膝骨关节炎的中成药常以活血镇痛、祛风散寒的药材为主。关于乳、没二药，中国很早就有其作为药物和香料使用的记载，由西方经陆路和海路传入中国，但也有记载称中国南方多有采集[17]。乳香之名始载于《名医别录》，《本草拾遗》、《本草纲目》均有涉及并沿用至今。乳香活血行气为主，长于散瘀，破泄力胜，没药活血散瘀为要，善于调气，止痛力强。二药参合，气血兼顾，取效尤捷，有通经活络，消肿止痛之功，故二药每每相兼而用[18]。乳、没二药均为天然树脂，是树的抗体系统在受到菇菌感染时分泌出的自愈油脂。乳香制剂在印度的传统医学中，常用于各种炎症性疾病治疗。

图1|药物与疾病共有靶点韦恩图

图2|“乳香-没药”活性成分-靶点和膝骨关节炎疾病-靶点的网络图

图3|“乳香-没药”治疗膝骨关节炎靶点蛋白互作网络

图4|“乳香-没药”治疗膝骨关节炎关键靶点GO分析(排名前20)

图6|背腹轴形成(Dorso-ventralaxisformation)治疗膝骨关节炎的分子功能富集分析

图5|“乳香-没药”治疗膝骨关节炎关键靶点KEGG分析(排名前20)

图7|河马信号通路(Hipposignalingpathway)治疗膝骨关节炎的分子功能富集分析

该研究中药成分与靶点的收集来源于西北农林科技大学王永华教授团队研发的TCMSP数据库[19]。疾病靶点的收集是基于GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank等数据库。通过研究发现，乳香的有效活性成分为因香酚、3-oxo-tirucallic,acid、乙酰基-α乳香酸、表大戟二烯醇、乳香酸、四环三萜类化合物[20]、扁枝烯等，现代药理学研究表明其有效成分具有抗炎、镇痛、抗菌等药理作用，还包括抗肿瘤、抗溃疡、改善记忆、抗哮喘、抗氧化作用等方面[21]。没药的有效活性成分为槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷、鞣花酸、花葵素、甾酮/醇类等化合物成分。现代药理学研究表明没药生物活性物质可以作用于神经系统、骨代谢系统，具有抗菌、消炎、活血止痛、抗肿瘤等作用[22]，抗炎与镇痛的作用在乳香与没药治疗膝骨关节炎中不容忽视。PPI蛋白互作网络表明，AKT1、TP53、IL-6、TNF、JUN、MAPK1等是“乳香-没药”治疗膝骨关节炎的关键靶点，JUN、MAPK1在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)信号通路中扮演重要角色，参与炎症与细胞增殖、分化、转录、调控和发育等多种应激反应，与神经病理性疼痛密切相关[23]。AKT1蛋白能够参与多种生物学过程包括代谢、增殖、细胞存活、生长、胰岛素信号传递和血管生成等；IL-6在炎症和B细胞成熟过程中发挥作用。这种蛋白主要产生于急性和慢性炎症部位，在那里它被分泌到血清中，该基因的功能与多种炎症相关疾病状态有关。该研究预测的这些关键靶点可以考虑作为今后治疗膝关节骨性关节炎的研究方向之一。

GO功能富集分析和KEGG通路富集分析主要与细胞代谢相关，根据分析显示富集排名靠前的通路主要有背腹轴形成、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、Hippo信号通路和受体复合体等。KEGG富集结果最显著的是背腹轴形成信号通路，此信号通路是脊椎动物胚胎早期发育过程中的关键步骤[24]，其分子机制是细胞分裂与分化的核心存在。转化生长因子β和骨形态发生蛋白信号通路在这个过程中发挥关键的作用，参与细胞增殖与分化的调控及多个组织、器官的形成和发育[25]。骨形态发生蛋白最早因其诱导异位骨形成被发现，是一类归属于转化生长因子β超家族的多功能胞外分泌蛋白[26,27]。膝骨关节炎是一种以关节及关节软骨损伤的退行性病变，人体中的各种细胞因子与关节软骨损伤修复、软骨细胞凋亡及骨关节炎的病理改变有密切关系，在组织构建和软骨修复中起到关键作用[28]。在损伤的关节软骨修复和重建中，细胞因子起着非常重要的作用，包括白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等在内的促炎性细胞因子可以促进大量的与关节软骨形成相关酶的产生，抑制关节软骨损伤。胰岛素样生长因子、转化生长因子等细胞生长因子可以为细胞黏附和生长提供环境参与关节软骨损伤修复和重建[29,30,31,32]。转化生长因子β/骨形态发生蛋白在骨形成修复中发挥重要作用，例如骨形态发生蛋白在多细胞胚胎中的浓度梯度都是固定的，通过调控细胞分化和介导背侧图式发育来建立背-腹轴[33]，并且其信号转导途径主要通过Smad信号通路以及非经典不依赖Smad的信号通路发挥作用，这二者在调控间充质干细胞成骨分化的信号转导过程中都会聚在RUNX2。RUNX2的转录协调功能和转化生长因子β/骨形态发生蛋白活化的Smad都对骨形成至关重要[25]。Hippo信号通路在成骨细胞与破骨细胞相互作用间的平衡和保持骨稳态中起着关键作用。大量的研究表明，Hippo信号通路可能在与NF-κB、MAPK和钙信号通路相互作用中发挥自己的作用。在Hippo信号通路和NF-κB信号通路中，RASSF2和MST2可分别通过抑制IKK和I-κBα活性来阻断NF-κB信号通路。在Hippo信号通路和MAPK信号传导途径中，Ajuba可以激活TRAF6,YAP/TAZ/TEAD可以激活ERK、JNK、p38和AP1。此外，在Hippo和钙信号传导途径中，YAP激活CREB和TEADs依赖于降低神经钙蛋白活性，从而抑制NFATc1[34,35,36,37]。

GO富集结果最显著的是细胞对缺氧的反应信号通路，低氧诱导因子由低氧诱导因子1α和低氧诱导因子1β两个亚基组成，在低氧环境下其能激活多种靶基因的转录，在细胞、组织生长发育中发挥重要的作用[38]。在炎症发生时，局部致炎因子增多，使血管扩张，血管壁通透性增加，导致更多的免疫细胞到达炎症部位。由于炎症细胞和抗原耗氧量的增加使血液流动减慢，在局部炎症部位形成一个低氧的环境。有研究发现，低氧环境与低氧诱导因子的激活出现在关节炎、肿瘤、动脉硬化和自身免疫性疾病患者的相应炎症部位[39]。免疫细胞对低氧的应答和NF-κB信号通路密切相关。在巨噬细胞、中性粒细胞和一些非免疫细胞中发现低氧诱导因子可以激活NF-κB[40]。低氧诱导因子1α的激活需要NF-κB和低氧的共同调节。巨噬细胞在缺乏低氧诱导因子1时表现为细菌吞噬能力降低、迁移能力减弱、炎性细胞因子的分泌降低。这与该研究通路富集的结果基本相符。

乳香、没药伍用，出自《证治准绳》中“乳香止痛散”。张锡纯《医学衷中参西录》云：“二药并用，为宣通脏腑，流通经络之要药，故凡心胃胁痛，肢体关节诸痛皆能治之。”乳香、没药与丹参、当归配伍，张锡纯命为活络效灵丹。二药气香走窜而善行，均能散瘀止痛，气淡薄偏入血分，长于散瘀，破泄力大。二药合用，气血并治，共奏宣通经络，活血祛瘀，消肿止痛，敛疮生肌之功。《本草纲目》云：“乳香活血，没药散血，皆能止痛、消肿、生肌，故二药每每相兼而用。”

“乳香-没药”在骨伤科临床应用十分广泛，其治疗膝骨关节炎的靶点复杂，通路多样，该研究借助网络药理学初步明确了“乳香-没药”的抗炎镇痛机制，尽管存在一定的局限性，但从整体层面分析了药物与疾病的关系，初步预测了“乳香-没药”药对治疗膝骨关节炎的关键作用靶标，探索了其治疗膝骨关节炎的可能作用机制。总之，该研究构建的成分-靶点-通路网络，为膝骨关节炎的治疗提供了理论依据，为临床医师用药提供了方向。

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基金:首都临床诊疗技术研究及示范应用项目(Z191100006619024),项目负责人:孙卫东;国家自然科学基金项目(81373802),项目负责人:孙卫东;北京市自然科学基金项目(7172244),项目负责人:孙卫东.