膝骨关节炎是骨科临床常见的慢性退行性疾病，世界卫生组织流行病学研究显示，该病在全球范围内60岁以上人群中男性发病率约为9.6%，女性约为18%，并有25%的致残率[1]。长久以来研究者多认为膝骨关节炎的发病以关节软骨退化、软骨下骨增生、骨赘形成等为主要病理改变[2]，但对病变过程中的非感染性关节滑膜炎症改变却未足够重视。近来有研究显示滑膜炎症与调节关节软骨代谢、细胞因子与蛋白酶的理化作用等密切相关[3,4]，但目前对关节滑膜炎症发病的分子机制研究仍较少。

根据患者膝关节肿胀、疼痛、积液、活动受限等常见表现，中医将膝骨关节炎归类为“痹症”“骨痹”范畴，其病机总属肝肾亏虚[5]；滑膜炎症病变为关节炎病变发展的一部分，基本病机亦属肝肾亏虚。中药杜仲具有补肝肾、强筋骨之功，是中医骨伤科治疗膝骨关节炎的常见药物，被广泛应用于中药方剂或中成药配伍中[6,7]。研究显示杜仲有效成分存在抑制关节炎滑膜成纤维细胞生长的作用[8]，具有治疗滑膜炎症病变的前景，但杜仲对膝骨关节炎病变过程的滑膜炎症病变作用的分子机制目前尚不明确。

获益于生物信息学与大数据分析的发展，中药网络药理学分析也飞速发展，成为一个探索预测中药治疗疾病潜在作用机制的重要工具，为实施具体实验提供了方向[9]。此次研究基于网络药理学分析与生物信息学数据挖掘理论方法，探索杜仲活性成分对膝骨关节炎滑膜炎症病变影响的可能分子机制，以期为膝骨关节炎的治疗提供新的靶点与方向。

1、资料和方法

1.1 杜仲有效活性成分筛选及作用靶点预测

采用中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)对杜仲活性成分进行收集，根据口服中药在人体内的药动学特性(ADME)参数对杜仲活性成分进行筛选[10,11]。以药物的口服生物利用度(oralbioavailability,OB)大于30%、类药性(druglike,DL)大于0.18为标准筛选获得杜仲有效活性成分[12,13]，并将TCMSP提供的杜仲有效活性成分作用疾病靶点信息收集整理。

1.2 滑膜炎症靶点基因挖掘筛选

在美国国立生物技术信息中心基因表达数据库(GENEEXPRESSIONOMNIBUS,GEO)以“KneeOsteoarthritis”(膝骨关节炎)、“Synovitis”(滑膜炎)为关键词检索相关基因芯片，获取编号为GSE46750、GSE55235、GSE82107的基因芯片原始数据及对应的基因注释文件。GSE46750芯片包含12个正常患者滑膜组织与12个非感染性炎症滑膜组织，GSE55235芯片包含10个正常关节滑膜组织与10个非感染性关节炎滑膜组织，GSE82107芯片包含7个正常对照组滑膜组织与10个非感染性炎症滑膜组织。

运用R语言对获取的3个基因芯片原始数据进行多矩阵数据归一与背景校正，运行R语言Limma程序包对基因芯片进行差异基因分析[14]，以检验统计P<0.05、差异倍数(foldchange,FC)绝对值>2为筛选条件，获得骨关节炎滑膜炎症病变的差异表达靶点基因。差异基因的FC>2则为上调基因，FC<2则为下调基因。

1.3 杜仲有效活性成分调控滑膜炎症靶标基因获取

将收集的杜仲有效活性成分作用疾病靶点基因，分别与滑膜炎症病变的上调基因与下调基因取交集，获得杜仲有效活性成分作用于膝骨关节炎滑膜炎症病变的上调基因与下调基因。

1.4 杜仲-活性成分-靶点基因调控网络构建

采用生物信息网络可视化分析软件CytoScapesoftware3.6.1对杜仲、有效活性成分及滑膜炎症差异表达靶点基因进行互作调控网络的构建[15]。将获得的有效活性成分、上调下调基因分类整理导入CytoScape软件中，以“节点”(Node)表示杜仲、活性成分及靶点基因，以“边线”(Edge)表示不同节点间的相互作用关系[16]，节点、边线互相连接，构成可视化网络。

1.5 靶点基因蛋白互作网络构建与关键基因筛选

采用基因蛋白互作在线分析工具STRING(https://string-db.org/)对获得的杜仲有效活性成分作用滑膜炎症靶点基因进行蛋白质-蛋白质互作(protein-proteininteraction,PPI)网络构建[17]。STRING网站对网络中靶点基因进行连接度(Degree)计算，Degree值越大，代表该靶点在网络中与更多基因发生互作关系，提示其重要性可能越大。根据Degree值大小进行靶点基因重要性排序，筛选出其中的关键基因。

1.6 靶点基因信号通路富集与基因本体论分析

使用R语言生物信息学分析工具包Bioconductor对获得的杜仲有效活性成分作用滑膜炎症靶点基因进行京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)通路富集分析与基因本体论(geneontology,GO)分析[18,19,20]，预测靶点基因主要参与的生物学功能注释过程与分子信号通路，以检验统计P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 杜仲有效活性成分及作用靶点收集

从TCMSP共检索获得杜仲活性成分147个，根据ADME药动学参数标准进行筛选，最终获得同时满足口服生物利用度(OB)>30%与类药性(DL)>0.18两个条件的杜仲有效活性成分28个，结果见表1。收集TCMSP提供的以上28个杜仲有效活性成分作用疾病靶点，对重复出现者进行剔除，共获得181个作用靶点基因。

2.2 滑膜炎症病变靶点基因收集

借助R语言Limma程序包将GSE46750、GSE55235、GSE82107三个基因芯片获得的32个滑膜炎症组织样本基因数据与29个正常对照组滑膜组织样本基因数据进行对比分析，并根据P<0.05与|FC|>2筛选显著差异表达的基因。结果获得表达上调基因171个，表达下调基因486个，对从基因芯片获得的全部基因根据校正后的P值及差异倍数取2的对数进行火山图绘制，展示上调与下调基因，见图1。

2.3 杜仲有效活性成分调控滑膜炎症病变靶点基因收集

将从TCMSP筛选后获得的28个杜仲有效活性成分作用的181个疾病靶点，分别与GEO基因芯片获得的滑膜炎症病变差异表达基因取交集，获得参与调控膝骨关节炎滑膜炎症病变的杜仲有效活性成分21个，上调表达基因7个，下调表达基因18个，以韦恩图(VennDiagram)形式展示交集基因结果，见图2。

表1|杜仲有效活性成分基本信息

2.4 杜仲-活性成分-滑膜炎症靶点基因调控网络可视化

将上述获得的21个作用于滑膜炎症病变的杜仲有效活性成分与差异表达基因数据共同导入至CytoScape软件中，构建杜仲-活性成分-滑膜炎症靶点基因调控网络，将分析结果以网络可视化图形呈现，网络图中共包含药物(杜仲)、活性成分以及调控滑膜炎症病变的上下调基因共47个节点，涉及77个相互作用关系，各节点间通过边线相连接，形成紧密的作用关系网络，见图3。

2.5 靶点基因互作网络关键基因筛选

将杜仲有效活性成分作用滑膜炎症病变差异表达基因25个上传至STRING网站，设置物种为“Homosapiens”(人类)，最小互作分数为0.4，运行靶点基因蛋白互作关系分析，将结果以TSV格式下载保存。通过R语言对靶点基因蛋白互作关系网络中靶点Degree值进行计算并排序，以条形图形式展现Degree值从高到低排名前20位的靶点基因及其Degree值，结果见图4。经计算，在差异基因互作网络中Degree值最高的是白细胞介素6(IL6)，其次为血管内皮生长因子A(VEGFA)、细胞趋化因子8(CXCL8)、FOS、JUN、基质金属蛋白酶9(MMP9)、PTGS2等，可能是杜仲活性成分调控膝骨关节炎滑膜炎症病变的关键基因。

2.6 靶点基因GO富集分析

对杜仲有效活性成分作用滑膜炎症靶点基因进行整理，运行R语言BioconductorclusterProfiler程序包对靶点基因进行GO富集分析[21]，筛选检验统计P<0.05的基因产物注释过程，并按照P值从小到大进行排序，展示排名前20的生物学过程，见图5。GO富集分析结果显示，靶点基因主要富集于细胞因子活性(Cytokineactivity)、细胞因子受体结合(Cytokinereceptorbinding)、超氧化物-生成NADPH氧化酶活性(Superoxide-generatingNADPHoxidaseactivity)、激活转录因子结合(Activatingtranscriptionfactorbinding)、受体配体活性(Receptorligandactivity)、R-SMAD结合(R-SMADbinding)、生长因子受体结合(Growthfactorreceptorbinding)、血红素结合(Hemebinding)等生物学过程。

图1|滑膜炎症病变差异基因火山图

图2|交集基因韦恩图

图3|杜仲-活性成分-靶点基因网络图

图4|靶点基因Degree值排序图

2.7 靶点基因KEGG通路富集分析

继续使用R语言BioconductorclusterProfiler程序包对靶点基因进行KEGG通路富集分析，筛选出P<0.05的富集信号通路，根据P值从小到大排序，对排名前20的信号通路进行可视化展示，见图6。KEGG通路富集分析结果显示，靶点基因主要富集于丝裂原活化蛋白激酶信号通路(MAPKsignalingpathway)、核因子κB信号通路(NF-kappaBsignalingpathway)、Tol样受体信号通路(Tol-likereceptorsignalingpathway)、缺氧诱导因子1信号通路(HIF-1signalingpathway)、破骨细胞分化信号通路(Osteoclastdifferentiation)、细胞衰老信号通路(Celularsenescence)等通路。

使用R语言BioconductorPathview程序包对靶点基因富集的KEGG信号通路进行细节展示[22]，将P<0.05的信号通路内容可视化，以便进一步了解靶点基因在各信号通路的各个阶段参与的信号转导过程。见图7，对靶点基因富集程度最高的MAPK信号通路细节展示，靶点基因CACNA1S、MYC、IL1B、FOS等分别富集于MAPK信号通路的不同环节，参与MAPK信号通路上下游的信号转导，调控基因转录、胞内外离子代谢等环节，并与肿瘤坏死因子信号通路(TNFsignalpathway)、细胞增殖分化(Proliferationdifferentiation)、炎症(Inflammation)、细胞周期(Cellcycle)等产生级联信号转导沟通。

3、讨论

膝骨关节炎是导致中老年人运动能力丧失的常见疾病，发病率高、致残率高，在全球老龄化趋势下给国家社会带来了沉重的经济负担[23]。膝关节非感染性滑膜炎症病变常被认为是膝骨关节炎过程中关节软骨退化、骨赘增生等结构变化带来的继发反应[24]。O’NEILL等[25]研究发现，中重度膝骨关节炎患者滑膜存在病理改变，不单纯是软骨退化、骨赘增生带来的继发反应，滑膜炎症病变对关节软骨、骨质会带来进一步破坏，导致膝骨关节炎患者关节肿痛等症状的加重，但目前滑膜炎症病变发病机制尚不明确，从分子机制探索其发病与治疗有着重要的理论价值与治疗导向作用[25]。

图5|GO富集分析结果

图6|KEGG信号通路富集分析结果

图7|MAPK信号通路图

中医理论一般将膝骨关节炎归于“痹症”“骨痹”范畴，其基本病机为肝肾亏虚，多因机体阳虚血瘀、精血不足、风寒湿邪外侵等原因，致气血凝涩、骨骼失养、筋脉痹阻发而为病[26,27]。杜仲为杜仲科植物杜仲的树皮，性甘微辛温，入肺肝肾经，功擅补肝肾，强筋骨，是中医骨伤科治疗骨关节炎的常用药物。此次研究立足中医辨证论治原则，结合网络药理学与生物信息学理论方法，对中药杜仲有效活性成分调控膝骨关节炎滑膜炎症病变基因产物相关分子机制展开探索。

此次研究基于中药系统药理学数据库及分析平台TCMSP共筛选获得杜仲中的丁子香萜、杜仲甙、杜仲脂素A、槲皮素等21个有效活性成分，直接作用于GEO基因芯片筛选获得的关节滑膜炎症病变的7个上调表达基因和18个下调表达基因，并根据药物-有效活性成分-差异表达基因之间的联系绘制出复杂调控网络图。

从图3网络图中可见，杜仲有效活性成分对滑膜炎症病变差异表达靶点基因调控作用存在以下几个特点：(1)山柰酚、槲皮素、β-胡萝卜素等活性成分均同时与多个靶点基因存在作用关系，提示同一活性成分对滑膜炎症病变的调控作用可能通过不同靶点基因发挥不同的作用；(2)靶点基因PTGS2、基质金属蛋白酶1、JUN等同时受到多个杜仲活性成分的作用，提示不同活性成分对同一靶点基因的调控可能存在协同作用；(3)部分活性成分同时作用于上调基因与下调基因，如槲皮素同时作用于22个靶点基因，其中包括6个下调基因，16个上调基因，提示其对关节滑膜炎症病变的作用可能是双向调控的。中药杜仲治疗膝骨关节炎滑膜炎症病变存在多成分、多靶点、协同调控、双向调控等特点，机制复杂，与中医辨证论治、整体观念思想相契合。

膝骨关节炎中滑膜炎症病变发病机制复杂，从GEO数据库提供的相关基因芯片测序结果获得了数以千计的基因与其生物学过程相关，根据统计学差异筛选出676个表达差异明显的基因，其中上调基因171个，表达下调基因486个，下调基因数量明显高于上调基因，占差异表达基因总数的71.89%。进一步与杜仲有效活性成分直接作用的疾病靶点基因取交集，获得其参与调控的7个上调基因与18个下调基因。靶点基因之间存在复杂的互作关系，利用STRING网站对所有靶点基因进行蛋白互作网络构建与分析，根据靶点基因之间连接度Degree值大小排序，初步认识靶点基因之间的联系与重要性。

在Degree值较高的前几位关键靶点基因中，分别包括白细胞介素6、血管内皮生长因子A、JUN、PTGS2等下调表达基因，细胞趋化因子8、FOS、基质金属蛋白酶9等上调表达基因。白细胞介素6是骨关节炎发病过程的重要分子[28]，研究证明白细胞介素6表达水平与骨骼肌肉系统非感染性炎症反应存在明显相关性，白细胞介素6的高表达将增加炎症组织中B淋巴细胞反应区域从而调动机体免疫系统，并影响关节软骨基质的退化[29,30,31]。血管内皮生长因子A通过刺激血管内皮细胞有丝分裂活动而促进血管新生，这对局部营养物质交换及炎症反应扩散是有利的[32]，血管内皮生长因子A适度的基因表达有助于滑膜细胞在缺氧环境中的修复，但过高的表达量反而导致滑膜细胞异常增殖及滑膜炎症的加剧[33]。细胞趋化因子8表达水平与滑膜炎症中血管新生及中性粒细胞游走密切相关[34],CAI等[1]通过将正常关节滑膜组织与膝骨关节炎患者滑膜组织进行免疫浸润分析，发现关节炎患者中细胞趋化因子8表达水平明显升高，可能与细胞趋化因子8激活记忆B淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞等免疫细胞的活动有关。基质金属蛋白酶9的作用主要是细胞外基质的降解和变革，高表达的基质金属蛋白酶9与滑膜炎症病变加重存在相关性，基质金属蛋白酶9是治疗滑膜炎症的重要靶点[35,36]。此次研究中筛选获得的多个杜仲有效活性成分调控的滑膜炎症靶点基因已被证明是对膝骨关节炎发病产生重要作用的靶点，是治疗滑膜炎症、减轻关节炎症状的重要靶点，杜仲活性成分可能通过对上述关键靶点基因的表达双向调控，从而调控机体的生物学过程、信号通路转导等环节发挥治疗作用。

靶点基因的KEGG信号通路富集分析提示杜仲活性成分调控滑膜炎症病变可能主要从炎症相关、细胞周期调控等通路发挥作用。

(1)细胞周期相关通路：(1)MAPK信号通路：丝裂原活化蛋白激酶是真核生物中非常保守的丝氨酸蛋白激酶，其下游信号通路与细胞增殖、分化，运动或凋亡有着密切联系，滑膜炎症产生的炎症因子激活MAPK信号通路，可导致基质金属蛋白酶升高而破坏关节软骨细胞[37]，也可能通过调控基因转录、胞内外离子代谢等环节影响滑膜细胞的增殖、分化与凋亡，同时MAPK信号通路与TNF信号通路、P53信号通路、炎症信号通路等均存在通路之间的沟通，调控作用复杂；(2)NF-kappaB信号通路：NF-kappaB信号通路激活诱导滑膜细胞产生大量趋化因子、细胞因子及基质金属蛋白酶，促进关节软骨分解破坏，加重对滑膜组织的刺激作用[38,39];(3)缺氧诱导因子1信号通路：缺氧诱导因子1是细胞缺氧状态下广泛参与外环境酸碱调控、细胞能量代谢、血管新生与细胞周期等生理进程的重要分子，介导软骨细胞、滑膜细胞在缺氧状态下的损伤修复[40,41]。

(2)炎症相关通路：(1)Toll样受体信号通路：骨关节炎患者机体CD14免疫因子可激活滑膜成纤维样细胞的Toll样受体(TLR2、TLR4)，产生炎症反应[42];(2)肿瘤坏死因子信号通路：肿瘤坏死因子具有明确的炎症介导作用，肿瘤坏死因子α可诱导白细胞介素6产生并进一步提高肿瘤坏死因子α活性，激活分解软骨、滑膜的蛋白酶，介导炎症发生[43]。

4、结论

综上所述，研究基于对膝骨关节炎滑膜炎症病变的中医肝肾亏虚病机辨证，利用生物信息学及网络药理学方法探索补肝肾、强筋骨中药杜仲有效活性成分调控滑膜炎症病变的可能分子机制。研究筛选获得21个参与调控膝骨关节炎滑膜炎症病变的杜仲活性成分与25个靶点基因，其调控作用可能通过抑制局部炎症、调控软骨细胞与滑膜细胞的细胞周期活动发挥。膝骨关节炎及其滑膜炎症病变机制复杂，中药杜仲活性成分具有治疗前景，后续仍需要设计严谨的具体实验对药物成分作用、靶点基因作用进一步验证，探索各活性成分在相关通路中对靶点基因的表达干预作用与调控作用，并最终服务于临床疾病治疗中，促进中医药现代化发展。

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基金:国家自然科学基金(81973878),项目负责人:尹恒.