白花蛇舌草饮片（Herba Hedyoti Diffusae）为茜草科耳草属白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）干燥全草入药，性甘味凉，主要成分为环烯醚萜、黄酮、多糖及蒽醌等，具有清热解毒、利尿消肿、活血散淤、保护神经等功效，以及抗氧化、抗炎、抗肿瘤与增强免疫力等药理作用[1-3]。白花蛇舌草在采收加工及储藏过程中易受微生物污染而产生霉变与虫蛀，导致药材质量下降。为确保药材饮片质量稳定和用药安全，需对白花蛇舌草进行灭菌处理，但目前鲜见其灭菌的相关研究。

电子束辐照灭菌技术为“冷灭菌”，可有效降低肉豆蔻（含有热敏性成分）的微生物水平且不会破坏其成分[4]。同时，该技术具有自动化程度高、能耗少、成本低及无辐射残留等优点，在食品和医疗器械等领域均有应用[5-6]。中药材种类多、化学成分复杂，灭菌对其化学成分及生物活性的影响关系用药安全及临床疗效[7]。但现阶段鲜见关于中药电子束辐照灭菌后药材饮片、制剂质量及安全性的报道[8-9]。

中药材的种类、产地和加工方式存在差异，难以用一刀切”的方式进行灭菌。现有研究表明，电子束辐照吸收剂量低于10 kGy时的中药灭菌效果良好[10-11]，灭菌后微生物水平符合《中华人民共和国药典2020年版四部》[12]规定；而较高吸收剂量会破坏天麻中的化学成分[13]，改变三七抗氧化活性[14]。综上，安全、合理的电子束吸收剂量可在保证灭菌效果的同时，不对其化学成分及理化性质产生较大影响。

为确定电子束辐照灭菌处理白花蛇舌草后是否产生毒性物质，采用体外细胞毒性试验进行安全性评价，对比细胞存活率的变化，考察电子束辐照灭菌对白花蛇舌草安全性的影响；同时，通过研究不同吸收剂量电子束灭菌下白花蛇舌草的微生物水平、化学成分含量、指纹图谱和体外抗氧化活性，建立多维度白花蛇舌草质量评价体系，旨在为电子束辐照灭菌技术在白花蛇舌草生产中的应用提供科学依据。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

中药白花蛇舌草饮片（Herba Hedyoti Diffusa）产自广西桂林，经吉林农业大学田义新教授鉴定为茜草科植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）的干燥全草。车叶草苷（RFS-G00911812016），成都瑞芬思生物科技有限公司；芦丁（RFS-G00402117002），纯度大于98.5%，北京科量技术有限公司。乙腈（色谱纯），美国TEDIA公司；乙酸（色谱纯），美国Celanese公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）、2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-3-氧代-1-氧（2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-3-oxide-1-oxyl,PTIO），纯度均大于98.5%，上海麦克林生化科技有限公司；铁氰化钾，北京化工厂；娃哈哈矿泉水，吉林娃哈哈食品有限公司；大鼠星状肝细胞（hepatic stellate cell-T6,HSC-T6）、优质胎牛血清、双抗灭菌液、细胞培养级磷酸缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）、DMEM/F12(Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12）培养基、0.25%胰酶消化液、细胞培养级二甲基砜蓝及其他试剂均为分析纯，大连美伦生物科技有限公司；二氧化碳、液氮，长春巨洋气体有限责任公司。

1.2仪器与设备

LC-15 C高效液相色谱仪、Waters SYNAPT G2超高效液相色谱-四极飞行时间质谱联用仪，日本岛津公司；UV-1801紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；BT25S型十万分之一电子仪，德国赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-500E超声波清洗仪，昆山市超声仪器有限公司；RT-6100酶标分析仪，深圳雷度股份有限公司；HF15IUV型二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司；TG18G型科析离心机，金坛市科析仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1电子束辐照灭菌样品制备

将白花蛇舌草全草切成1～2 cm的段，分别置于10个密封袋中，每袋100 g。用0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 kGy吸收剂量辐照，其中0 kGy为未辐照样品。

1.3.2微生物限度检查

参照《中华人民共和国药典2020年版四部》[12]中的非无菌产品微生物限度计数法、1107非无菌药品微生物限度标准检测白花蛇舌草的微生物限度。

1.3.3供试品溶液制备

精密称取白花蛇舌草样品粉末1.0 g，置于25 mL具塞锥形瓶中，加30%甲醇至刻度，称重，超声40 min，补足失重，摇匀，过滤待用。

1.3.4对照品溶液制备

分别精密称取芦丁、车叶草苷适量，加30%甲醇使其溶解，制成浓度为0.1 mg·mL-1的芦丁、车叶草苷混合溶液。

1.3.5色谱条件

参照陈妍等[15]的方法测定样品。Agilent HC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm），流动相：0.1‰乙酸乙腈（A)-0.1‰乙酸水溶液（B），梯度洗脱：0～5 min 2%B、35 min 30%B、50 min 60%B、55～60 min 100 B，流速1 mL·min-1；柱温40℃；检测波长238 nm，进样量10μL。

1.3.6样品中芦丁及车叶草苷含量测定

根据“1.3.3”“1.3.4”供试品、对照品溶液制备方法及“1.3.5”的色谱条件进行分析和计算。

1.3.7灭菌前后白花蛇舌草高效液相指纹图谱(high-performance-liquid-chromatography,HPLC）的建立

根据“1.3.5”的色谱条件建立白花蛇舌草的指纹图谱，并将数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年130723版本），生成不同吸收剂量辐照灭菌白花蛇舌草样品的指纹图谱。

1.3.8质谱法色谱峰结构确认

采用Q-TOF质谱仪进行液质联用（liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS）分析，电喷雾电离-质谱，正负离子检测模式，样品锥电压35 V，喷雾电压正离子3 000 V，负离子2 400 V，源温150℃，去溶剂气为氮气，温度300℃，流速300 L·h-1，进行正负离子扫描。

1.3.9 DPPH·抗氧化活性测定

将“1.3.3”的供试品溶液稀释为2、4、6、8 mg·mL-1溶液。参照陈仁强等[16]的方法，于520 nm处测定吸光度，并进行DPPH·抗氧化试验。按下式计算DPPH·清除率：

清除率=A0-()A样品溶液-A样品对照A0×100%

式中，A样品溶液为样品溶液的吸光度值；A样品对照为样品对照溶液的吸光度值；A0为对照溶液的吸光度值。

1.3.10 PTIO·抗氧化活性测定

取“1.3.3”的提取液5 mL于50℃水浴蒸干，残渣用1 mL 30%甲醇溶解，得200 mg·mL-1的白花蛇舌草溶液。将上述溶液进一步稀释成50、100、150、200 mg·mL-1待测液。参照黎海梅等[17]的方法，于560 nm处测定吸光度，并进行PTIO·抗氧化试验。按照“1.3.9”公式计算PTIO·清除率。

1.3.11铁氰化钾还原力测定

将25 mg·mL-1白花蛇舌草溶液稀释成2.5、5.0、7.5、10.0 mg·mL-1溶液，参照王存琴等[18]的方法测定690 nm处的吸光度。1.3.12HPLC DPPH

1.3.12 HPLC法分析白花蛇舌草与过量DPPH·反应

参照张禄捷[19]、Candido Júnior等[20]的方法，取25 mg·mL-1白花蛇舌草的30%甲醇提取液2 mL，加1 mmol·mL-1DPPH·溶液2 mL，混合后于25℃恒温避光保存。于反应30、60、120 min时，按照“1.3.5”液相色谱条件进行分析，与白花蛇舌草的30%甲醇提取液液相色谱比较，分析白花蛇舌草中不同物质于不同时间与DPPH·反应后的变化情况，计算共有峰与DPPH·的反应量与反应率。

1.3.13细胞存活率样品溶液的制备

取未灭菌及10 kGy吸收剂量处理的白花蛇舌草样品，粉碎，过50目筛，分别精密称取1.0 g，加10 mL超纯水超声提取2次，每次15 min，合并两次提取液，于10 000 r·min-1离心10 min，取上清液预冻，冷冻干燥机干燥（冷井-40℃，负压10 MPa）。精密称取适量冷冻干燥固体，置于离心管中，加完全培养基超声溶解，摇匀，用无菌过滤器过滤，制成浓度为2 mg·mL-1溶液作为贮备液，用完全培养基稀释为2 000、1 000、500、250、125μg·mL-1浓度系列。

1.3.14细胞存活率的测定

取处于对数生长期且细胞密度为5×105ind·mL-1的HSC-T6细胞悬液，植入96孔板中，每孔加入100μL细胞液，在培养箱温度37℃、CO2浓度5%条件下培养24 h至细胞贴壁。弃去培养液，用磷酸缓冲液清洗2～3遍。精密吸取不同浓度的白花蛇舌草样品溶液各100μL加入96孔板中作为给药组，对照组为新鲜培养液，所有受试物每个剂量组设6复孔作为平行试验组，放入培养箱中分别培养24、48、72 h后，弃上清液，PBS清洗2～3遍。配制浓度为5 mg·mL-1的二苯基四氮唑溴盐（简称噻唑蓝）[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]溶液，每孔加入20μL MTT溶液，放入CO2培养箱中反应4 h，弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜溶液，摇床低速震荡15 min，用酶标仪测定450 nm处的吸光度，计算细胞存活率。

2、结果与分析

2.1电子束辐照灭菌对白花蛇舌草微生物水平的影响

由表1可知，不同吸收剂量下白花蛇舌草样品中均未检出耐热菌。需氧菌、霉菌和酵母菌含量随吸收剂量的增加均大幅度降低。大肠埃希菌及沙门菌均未检出，耐胆盐革兰阴性菌水平均在10 CFU·g-1以下。≥4 kGy吸收剂量有较好的灭菌效果，样品中微生物限度均符合《中华人民共和国药典2020年版四部》[12]标准。当吸收剂量大于10 kGy时，样品中需氧菌、霉菌、酵母菌、大肠埃希菌、沙门菌及耐热菌均未检出，耐胆盐革兰阴性菌含量在10 CFU·g-1以下。表明电子束辐照灭菌技术可充分灭杀中药白花蛇舌草中的微生物，具有良好的灭菌能力。

表1不同吸收剂量下的微生物限度

2.2电子束辐照灭菌对白花蛇舌草中芦丁、车叶草苷含量的影响

黄酮类与萜类成分是白花蛇舌草的主要活性成分，具有良好的抗氧化活性[21]。由表2可知，不同吸收剂量芦丁、车叶草苷的平均含量分别为0.198、0.406,t检验测得的P值分别为0.999、0.956，均大于0.05。表明电子束辐照灭菌未对白花蛇舌草中芦丁、车叶草苷含量产生明显影响。

2.3电子束辐照灭菌对白花蛇舌草HPLC指纹图谱的影响

图1为不同电子束吸收剂量的指纹图谱，S1～S10为0～18 kGy电子束指纹图谱。以未灭菌的样品指纹图谱为参照，经Mark峰比对确定了14个共有峰，不同吸收剂量F指纹图谱与对照指纹图谱相似度分别为0.981、0.993、0.982、0.997、0.998、0.975、0.965、0.982、0.989、0.974。尽管14号峰（十六烷酸甲酯）含量随着电子束吸收剂量的增加而减少，但整体相似度结果均高于0.90，表明不同吸收剂量灭菌未明显影响白花蛇舌草的总体化学成分，灭菌后样品化学成分相对稳定。

2.4 LC-MS对14个共有峰的确认

利用Mass Bank数据库检索和文献对比，结合质谱的碎片峰分析，确认了14个共有峰结构[22-23]（表3）。14个共有峰主要包括萜类（6、9、11）、蒽醌类（3、7、12）、黄酮类（8）、挥发油类（1、2、4、5、14）、苷类（13）及吡喃类化合物（10）等。

表2不同吸收剂量下白花蛇舌草样品中的芦丁、车叶草苷含量

2.5 DPPH·和PTIO·抗氧化活性及铁氰化钾还原力

由表4可知，2～10 kGy吸收剂量下，白花蛇舌草的DPPH·、PTIO·抗氧化活性变化较小；大于10 kGy吸收剂量下，DPPH·、PTIO·抗氧化活性降低，半抑制率（half maximal inhibitory concentration,IC50）值升高。2～18 kGy吸收剂量下，铁氰化钾还原力的变化较小。以上表明，≤10 kGy吸收剂量下白花蛇舌草的体外抗氧化能力相对稳定。

图1不同吸收剂量下白花蛇舌草样品指纹图谱及共有峰

表3白花蛇舌草共有峰确认结果

表4不同吸收剂量下白花蛇舌草样品3种抗氧化活性

2.6灰色关联度分析（grey relation analysis,GRA)

分别以灭菌后白花蛇舌草样品DPPH·、PTIO·清除率及铁氰化钾还原力为母序列，14个共有峰的峰面积为子序列，进行标准化处理并导入SPSSPRO数据在线分析平台（www.spsspro.com），得14个共有峰成分与抗氧化活性的关联度（r）。由表5可知，r均大于0.50，表明白花蛇舌草样品的抗氧化作用是多成分协同作用的结果。综合来看，抗氧化活性关联度较强（r>0.70）的10个成分峰号依次为8、5、10、7、6、3、2、1、11、12，为白花蛇舌草中主要体外抗氧化活性物质。

表5指纹图谱共有峰与DPPH·、PTIO·清除率及铁氰化钾还原力的关联度

2.7白花蛇舌草与过量DPPH·反应率

由表6可知，反应率大于50%的峰号为8、10、11号峰；2、3、12号峰的反应率均随反应时间的增加而增加，但峰面积变化量小于8、10、11号峰，表明其抗氧化能力相对较弱，1、4、5、9、13、14号峰反应后的峰面积较反应前升高，可能是反应物与反应产物的色谱峰相重叠所致。

2.8电子束辐照灭菌对白花蛇舌草细胞存活率的影响

由表7可知，灭菌前后24、48、72 h的细胞存活率均大于50%,t检验显示，相同给药浓度细胞存活率均无显著差异（P>0.05）。上述结果表明，经电子束辐照灭菌后的白花蛇舌草水提液未对HSC-T6细胞产生毒性。

表6 DPPH·反应前后共有峰峰面积、变化量及反应率

表7不同浓度白花蛇舌草水提液在不同培养时间下的HSC-T6细胞存活率

3、讨论

本研究采用2～18 kGy吸收剂量的电子束辐照白花蛇舌草样品，当吸收剂量大于4 kGy时，需氧菌、霉菌和酵母菌总数、耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、耐热菌均符合《中华人民共和国药典2020年版四部》[12]规定，与商飞飞等[10]、何毅[11]的研究结果相似，表明4 kGy以上的辐照吸收剂量具有良好的灭菌能力。同时《中药辐照灭菌技术指导原则》[7]规定的安全吸收剂量为10 kGy，故在保证灭菌效果的情况下，白花蛇舌草灭菌的建议吸收剂量为4～10 kGy。

前人研究表明，高剂量电子束辐照灭菌会改变中药饮片及食品中的化学成分含量与抗氧化活性，破坏有机物结构。本研究通过t检验分析发现，吸收剂量10 kGy以下白花蛇舌草样品中化学成分总含量、3种体外抗氧化活性较未辐照无显著差异（P>0.05）。同时，灭菌后与未灭菌指纹图谱间的相似度均大于0.90，表明在安全吸收剂量内辐照未对白花蛇舌草质量产生影响。当吸收剂量高于10 kGy时，白花蛇舌草的抗氧化能力随吸收剂量的增加而下降，与瞿桂香等[24]、程竹林等[25]的研究结果类似，即电子束吸收剂量大于10 kGy会改变小龙虾中蛋白质、枸杞多糖结构及抗氧化活性。且当吸收剂量高于10 kGy时，白花蛇舌草中的十六烷酸甲酯（14号峰）含量呈明显降低趋势，而车叶草苷及芦丁含量无明显变化，可能与高能电子束会破坏甲酯类等结构有关[26-27]。张立雯等[28]研究辐照灭菌后的秦艽及龙胆发现，龙胆苦苷、獐芽菜苦苷等成分含量随电子束吸收剂量的增加而显著下降，但马钱苷酸及当药苷含量无显著变化。此外，乜世成[29]研究发现，电子束辐照能破坏裸藻β-葡聚糖中的糖苷键。综上，推测高剂量电子束辐照会破坏白花蛇舌草中的多糖结构[30]，但具体原因有待进一步探究。

中药体外细胞毒性试验通过检测样品对细胞存活率的影响来评估样品的生物安全性。其中，楚璇[31]研究不同紫外吸收剂量对苹果汁HepG2细胞的毒性发现，不同吸收剂量未对细胞存活率产生影响；冯鑫[32]研究10 kGy灭菌前后生肌膏对真皮成纤维细胞增殖与凋亡的影响发现，灭菌前后细胞存活率无显著差异。与上述结果类似，本研究中白花蛇舌草经10 kGy吸收剂量辐照灭菌后，HSC-T6存活率较未灭菌样品无显著差异，表明10 kGy电子束辐照未影响其安全性。

中药谱效关系可将中药化学成分与药理活性结合，被广泛应用于中药质量评价研究[33]。本研究确定的14个共有峰成分与抗氧化活性的灰色关联度相关性均大于0.5，表明白花蛇舌草的抗氧化活性是多种成分协同作用的结果。为进一步确定白花蛇舌草中不同化学成分抗氧化活性强弱，将白花蛇舌草的30%甲醇提取液与过量DPPH·反应，发现11号峰（乙酰羽扇豆醇酯）、8号峰（芦丁）、10号峰（3,4-二氢-4-羟基-6-甲氧基-2H-苯并吡喃）的反应率均在50%以上，表明上述3种化合物的抗氧化活性较好，这与灰色关联度评价结果基本一致。其中，8、11、10号峰分别属于黄酮类、萜类、吡喃类化合物，均为白花蛇舌草中具有良好抗氧化活性的物质。

4、结论

本研究结果表明，电子束辐照灭菌对白花蛇舌草具有良好的灭菌效果，吸收剂量≤10 kGy对白花蛇舌草质量无明显影响，高吸收剂量会降低白花蛇舌草的体外抗氧化活性，白花蛇舌草灭菌的安全吸收剂量为4～10 kGy。

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文章来源:姜榃,于敏,焦连庆,等.多维度评价电子束辐照灭菌对白花蛇舌草质量的影响[J].核农学报,2024,38(10):1922-1929.