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单细胞测序揭示自然杀伤细胞在青年和老年重症肺结核患者中差异

2024-09-05 59 上传者：管理员

摘要：目的:探讨青年和老年重症肺结核患者中的免疫细胞亚群差异，重点关注自然杀伤细胞（NK细胞）亚群相关功能和通路。方法:通过与公开研究文献的通信作者联系，获取4例重症肺结核患者[其中，2例青年患者（年龄≤40岁）,2例老年患者（年龄≥65岁）]的单细胞测序数据和其他临床相关指标。对研究对象单细胞RNA测序数据进行质控、统计，去除不合格的细胞后，进一步进行非线性降维和聚类。利用公认的细胞标志物对相关免疫细胞进行注释，统计各样本和分组中的细胞类型百分比，比较各细胞亚型在不同分组中的变化趋势。同时，比较不同细胞类型之间的差异基因，通过京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome, KEGG）富集分析探索这些基因在生物过程和通路中的作用。结果:对来源于重症肺结核青年患者中的15 359个细胞和老年患者的9571个细胞进行注释，共鉴定到11个细胞亚群，占比最多的细胞类型分别是单核细胞（61%）、CD4+ T细胞（17%）、CD8+ T细胞（8%）、巨核细胞（5%）、B细胞（4%）及NK细胞（3%）。分析发现，青年患者NK细胞百分比[中位数（四分位数）:4.339%（3.955%,4.722%）]高于老年患者[中位数（四分位数）:0.822%（0.813%,0.831%）],但差异未见统计学意义（Z=-0.431,P=0.667）;利用观察到的细胞数与期望细胞数的比值（Ro/e）统计学方法分析同样显示NK细胞在青年组中呈现增多趋势。进一步对NK细胞聚类分析揭示了3种不同NK细胞亚群，青年患者中高表达CD16的NK细胞百分比[中位数（四分位数）]为44.409%（41.672%,47.147%）,略高于老年患者[中位数（四分位数）:35.172%（32.169%,38.174%）],但差异未见统计学意义（Z=-0.431,P=0.667）。对比CD16高表达的NK细胞和中表达的NK细胞发现存在435个明显变化的基因，其中高表达的基因388个，低表达的基因47个。KEGG结果显示差异表达基因主要集中作用在细胞感知、细胞因子、B细胞受体、抗原加工提呈等信号通路。结论:本研究通过分析青年和老年重症肺结核患者外周血免疫细胞之间的差异，揭示了青年重症肺结核患者中NK细胞百分比，以及CD16+ NK细胞百分比增多，为肺结核患者的分级临床治疗提供了新的理论依据和潜在治疗靶点。

关键词：
RNA
免疫反应
序列分析
淋巴细胞;
结核
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结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)与宿主的免疫反应相互作用，影响结核病的严重程度及临床治疗结果。而制定预防和控制结核病有效策略的主要障碍之一是对于宿主和MTB的相互作用知之甚少。因此，全面表征结核病患者的免疫景观就显得非常必要，这有利于进一步剖析与疾病严重程度相关的潜在变化。近年来，单细胞RNA测序(scRNA-seq)在剖析免疫反应方面展现出强大的能力[1-2],已被广泛应用于新型冠状病毒等病原体感染[3]。在本研究中，笔者分析了青年和老年肺结核患者的单细胞测序数据，以获得年龄相关的活动性肺结核患者中综合免疫反应的全景观。研究结果将填补对MTB致病性和保护性免疫反应的年龄相关的理解空白，为老年重症肺结核患者提供潜在的新治疗靶点。

1、资料和方法

1.数据下载和预处理：

通过与公开研究文献[4]通信作者联系，获取肺结核患者的单细胞测序数据和其他临床相关指标。根据研究中的标准定义肺结核晚期重症患者：肺部病变总范围大于全肺的1/2;或致密且汇合的病变范围占单侧肺的1/3以上；或空洞直径≥4 cm;或胸腔积液延伸至隆突2 cm以外，C反应蛋白≥75 mg/L,动脉血氧分压(PO2)<80 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或氧合指数<300 mmHg。

选取年龄≤40岁的肺结核患者2例，定义为青年肺结核患者；年龄≥60岁的肺结核患者2例，定义为老年肺结核患者；共计4例患者的数据进入下一步分析。研究对象具体临床资料信息见表1。

2.单细胞数据分析：

利用Seurat软件包[5]对每个样本的测序数据进行读取表达矩阵，计算每个样本中线粒体基因含量，通过以下参数过滤不合格的细胞：(1)200个<基因数<8000个；(2)检测到的总分子数<20 000;(3)线粒体基因计数<20%。

过滤不合格的细胞后，利用Seurat软件中的“NormolizedData”算法对数据进行标准化校正。接下来，计算数据集中表现出较高的细胞间差异的2000个特征基因(即：它们在某些细胞中高度表达，而在其他细胞中表达较低)。之后，利用“ScaleData”算法对数据实现线性变换后执行主成分分析。随后利用“FindNeighbors”算法对前10个主成分进行降维后，利用“FindClusters”算法设定分辨率为0.5,对数据进行降维和聚类分析，再利用“RunUMAP”算法对数据进行非线性降维后用“DimPlot”函数进行绘图。最后，利用公认的细胞表面标志物对细胞类型进行注释。

表1研究对象临床资料

图1重症肺结核患者单细胞RNA细胞类型分析

3.差异基因表达和通路分析：

比对自然杀伤细胞(NK细胞)亚群之间的差异基因时，利用“FindMarkers”函数分析CD16强阳性和CD16弱阳性NK细胞间的差异。如果某个基因的|log2变异倍数|>1且校正后的P<0.05,则被认为是明显变化的基因。对这些基因利用clusterProfiler软件包[6]进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome, KEGG)[7]代谢途径和信号通路分析。

4.组间差异细胞群分析：

使用python语言中的scipy包(版本号：1.10.1)进行统计分析，偏态分布的计量资料以“中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]”描述，组间差异的比较采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。同时，利用观察到的细胞数与期望细胞数的比值(Ro/e)统计方法，量化每个细胞亚群对分组的偏好程度。

2、结果

1.单细胞RNA细胞类型分析：

对研究对象的数据进行过滤后统计共得到24 930个细胞，其中，青年患者15 359个细胞，老年患者9571个细胞。对所有细胞进行非线性降维和注释后共计得到11个细胞群体(图1A),包含B细胞、CD4+/CD8+T细胞、树突状细胞(DC细胞)、黏膜相关恒定T细胞(mucosal-associated invariant T cell, MAIT细胞)、巨核细胞(Megakaryocyte)、单核细胞(Monocyte)、NK细胞、浆细胞(Plasma B)、浆母细胞(Plasmablast)、γδT细胞。对各细胞亚群百分比统计发现，位于前几位的细胞依次为单核细胞(61%)、CD4+T细胞(17%)、CD8+T细胞(8%)、巨核细胞(5%)、B细胞(4%)及NK细胞(3%),见图1B。

2.青年和老年组间细胞亚型差异分析：

为明确各细胞亚型在青年和老年患者间的差异，将注释后的细胞分成2组，总体上青年和老年间的细胞亚型存在分布差异(图2A)。进一步统计各细胞类型在分组中的百分比发现，青年组中单核细胞百分比下降，CD4+/CD8+T细胞和NK细胞百分比上升(图2B,表2)。为比较各细胞群的上升趋势是否存在明显差异，对其百分比进行了统计分析，发现青年组中NK细胞百分比高于老年组，CD4+/CD8+T细胞、单核细胞百分比均有变化，但差异均未见统计学意义(表2)。Ro/e统计学方法分析同样显示NK细胞在青年组中呈现增多趋势(图2B)。

表2青年和老年重症肺结核患者各主要细胞亚群变化

图2青年和老年重症肺结核患者细胞亚型差异分析

表3青年和老年重症肺结核患者中各自然杀伤细胞亚群变化

图3青年和老年重症肺结核患者间自然杀伤细胞分析

图4CD16+自然杀伤细胞特征性基因和通路分析

3.CD16+NK细胞在青年患者中呈现增多趋势：

既往报道NK细胞的主要亚型为未分化的幼稚NK细胞，CD56+NK细胞和CD16+NK细胞。为进一步明确NK细胞在肺结核患者中的角色，提取了两组中全部NK细胞，对其进行非线性降维及注释，共计得到3个NK细胞亚群：高表达CD16的NK细胞、高表达CD16的幼稚NK细胞和中表达CD16的幼稚细胞(图3A)。统计NK细胞亚群百分比发现，高表达CD16的NK细胞在青年患者中百分比增多，尽管3个细胞亚群在青年和老年患者中的差异无统计学意义(表3),但Ro/e统计学方法分析证实高表达CD16的NK细胞在青年组中呈现增多趋势(图3B)。

4.CD16+NK细胞特征性基因及通路分析：

为进一步明确CD16+NK细胞特征性基因及通路，对CD16+NK细胞和CD16低表达NK细胞之间的差异基因进行了分析，共计得到435个明显变化的基因，其中高表达的基因388个，低表达的基因47个(图4A)。KEGG结果显示，差异表达基因主要集中作用在细胞感知、细胞因子、B细胞受体、抗原加工提呈等信号通路(图4B),提示CD16+NK细胞具有免疫功能的相关特征。

3、讨论

据报道，各年龄阶段肺结核患者均出现咳痰、发热、胸闷等症状，但细分各症状的比例发现老年组高于儿童组、成年组，说明肺结核的症状与年龄存在潜在关联[8]。潜在的原因是老年肺结核患者免疫功能低下、营养不良，或合并其他常见心脑血管疾病，因此，易造成肺结核反复发作，同时典型症状容易被其他疾病所掩盖，从而导致临床漏诊、误诊，最终可能导致死亡的发生。此外，老年肺结核患者治愈率低，因此，尽早诊治是提高老年肺结核治愈率的重要研究方向[9-10]。

本研究通过分析青年和老年重症肺结核患者的免疫全景观差异，发现青年组中NK细胞百分比高于老年组，加之本研究中2例老年重症患者的临床结果均为死亡，而青年患者均为缓解，此结果提示NK细胞可能与年龄相关的治疗结果。对NK细胞亚型分析发现，高表达CD16的NK细胞在青年患者中百分比增多，说明高表达CD16可能对结核病患者的预后起正向作用。NK细胞是非常重要的先天性免疫细胞，可以通过细胞毒性及释放促炎因子来响应病毒侵染及肿瘤发生。CD56,又被称作神经细胞相关黏附分子，在人NK细胞上的表达强度被视为一种功能指标。在血液中NK细胞的两个主要群体为CD56Dim(CD56表达水平较低)和CD56bright(CD56表达水平较高)。一般认为，CD56Dim的NK细胞(占NK细胞总数90%)是细胞毒性的，CD56bright的NK细胞(占NK细胞总数10%)是抑制性的(产生细胞因子)。本研究发现NK细胞均低表达CD56,也就是有细胞毒性的NK细胞，此结果提示肺结核患者体内的NK细胞持续发挥非特异性免疫的功能。另一个典型的NK细胞标志CD16,能导致抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC效应),在本实验中，发现NK细胞均高表达CD16,而CD16表达增强了NK细胞对抗体调理细胞的识别能力并直接杀死这些细胞。

宿主防御MTB感染的主要武器是细胞介导的免疫，之前的研究重点关注了T细胞杀灭和清除MTB的作用[11],以及NK细胞参与抗MTB的分子机制。而NK细胞占肺常驻淋巴细胞的比例达15%,这预示了其在抗MTB感染中的潜在作用[12]。虽然目前NK细胞在分枝杆菌感染中的功能尚不清楚，但推测NK细胞可能参与分枝杆菌感染的早期先天免疫反应[13],同时，也有研究在结核病患者的肝脏和脾脏中发现了活化的NK细[14]。MTB感染后，肺部的NK细胞群会扩增并表达与激活相关的标志物，产生穿孔素和γ-干扰素(IFN-γ),进而激活NK细胞[15]。此外，NK细胞也会重塑T细胞的功能：当从健康个体的外周血单核细胞(PBMC)中去除NK细胞时，用MTB抗原刺激后，γδT细胞的增殖能力大大降低；CD8+T细胞裂解MTB感染的单核细胞的效率也降低了，且特异性分泌IFN-γ的CD8+T细胞的数量也减少了[16]。

为进一步明确CD16+NK细胞特征性基因及通路，笔者比较了CD16+和CD16低表达NK细胞之间的差异基因，共计得到高表达的基因388个，低表达的基因47个。其中，表达差异最明显的基因为MRPL3、LYZ、EIF1AY和SIRT6。对所有明显变化的基因进行KEGG通路分析发现，这388个基因主要集中作用在细胞感知、细胞因子、B细胞受体、抗原加工提呈等信号通路。上述结果提示CD16+NK细胞具有免疫功能的相关特征。

本研究具有一定的局限性。首先，本研究纳入的样本数量有限，青年和老年重症肺结核患者各2例，患者未能按照性别比1∶1入组，这可能会忽略由于性别导致的免疫全景观差异。其次，老年组有1例患者为播散性肺结核，这可能会对后续的分析造成一定的偏倚。

综上所述，本研究通过分析青年和老年重症肺结核患者外周血免疫细胞之间的差异，揭示了CD16+NK细胞在青年重症肺结核患者中增多，具有免疫功能的相关特征，提示其在重症肺结核中的重要作用，从而为肺结核患者的分级临床治疗提供了新的理论依据和潜在的治疗靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献唐蜜：采集数据、分析/解释数据、起草文章、对文章的知识性内容作批评性审阅、统计分析、获取研究经费；李瑶：实施研究、采集数据、分析/解释数据、对文章的知识性内容作批评性审阅、统计分析；胡艳梅和文新民：实施研究、采集数据、统计分析；唐志冈和黄晟：采集数据、统计分析、支持性贡献；张勇和罗丹霖：采集数据、统计分析；易恒仲：酝酿和设计实验、实施研究、对文章的知识性内容作批评性审阅、获取研究经费、行政/技术/材料支持、指导

参考文献:

[1]魏祎,王旭,王立,等.原发性胆汁性胆管炎中单细胞转录组测序技术的应用进展.中华临床免疫和变态反应杂志,2024,18(1):63-67.doi:10.3969/j.issn.1673-8705.2024.01.011.

[2]杨欣莉,张文.IgG4相关性疾病2023年度进展.中华临床免疫和变态反应杂志,2024,18(1):41-44.doi:10.3969/j.issn.1673-8705.2024.01.007.

[9]代炳芹,张艺馨,孙晓英,等.2013―2022年山东省65岁及以上老年人肺结核流行特征及空间聚集性.中华疾病控制杂志,2024.28(2):131-137.doi:10.16462/j.cnki.zhjbkz.2024.02.002.

[10]康小娟,王晓辉,丁中航.2015―2022年甘肃省传染病流行特点及趋势.中华疾病控制杂志,2024,28(4):381-388.doi:10.16462/j.cnki.zhjbkz.2024.04.002.

基金资助:长沙市自然科学基金(kq2208097;kq2208096);湖南省自然科学基金面上项目(2023JJ30335);湖南省科技创新平台与人才计划(2018SK7003)~~;

文章来源:唐蜜,李瑶,胡艳梅,等.单细胞测序揭示自然杀伤细胞在青年和老年重症肺结核患者中的差异[J].中国防痨杂志,2024,46(09):1030-1036.