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高效液相色谱法测盐酸普萘洛尔中同分异构体杂质β-普萘洛尔含量

2024-09-20 41 上传者：管理员

摘要：目的建立HPLC法测定盐酸普萘洛尔中同分异构体杂质β-普萘洛尔的含量。方法采用YMC-Pack ODS-AQ（150 mm×4.6 mm，3 μm）色谱柱，以十二烷基硫酸钠和磷酸二氢四丁基铵溶液-乙腈（70∶30）为流动相A，以十二烷基硫酸钠和磷酸二氢四丁基铵溶液-乙腈（30∶70）为流动相B，在线等度洗脱A-B（70∶30），流速为0.8 mL•min-1，检测波长为225 nm，进样体积为20 μL。结果 β-普萘洛尔检测限为0.1 ng，定量限为0.3 ng；β-普萘洛尔在0.015～1.981 μg•mL-1内呈良好的线性关系（r=0.9999）；低、中、高水平的平均回收率分别为99.06%、100.4%、100.5%，RSD分别为0.18%、0.10%、0.060%（n=3）。结论本法简便、灵敏、准确、可靠，可为盐酸普萘洛尔原料药中β-普萘洛尔的质量控制提供参考。

关键词：
HPLC法
β-普萘洛尔
同分异构体杂质
心律失常
盐酸普萘洛尔
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盐酸普萘洛尔化学名为1-异丙基-3-(1-萘氧基)-2-丙醇盐酸盐(见图1)，为非选择性竞争抑制β-肾上腺受体阻滞剂，临床中常用于高血压、心律失常和心绞痛的治疗。近年来临床研究发现普萘洛尔可以抑制内皮细胞血管生成，诱导血管瘤内皮细胞凋亡，已成为婴幼儿血管瘤治疗的一线药物[1-3]。

β-普萘洛尔化学名为1-(异丙基氨基)-3-(萘-2-基氧基)丙-2-醇(见图1)，是盐酸普萘洛尔合成过程中起始物料α-萘酚中混入的β-萘酚的副产物[4]。目前各国药典标准均未收载β-同分异构体杂质的控制要求[5-9]。

图1β-普萘洛尔(A)和普萘洛尔(B)的结构式

β-普萘洛尔与普萘洛尔的结构相似，主要差异为侧链取代基在萘环的β位和α位，两者理化性质相近，在各国药典方法色谱条件中均无法进行有效分离和质量控制。张树栋等[4]报道了盐酸普萘洛尔原料药及片剂有关物质检测方法的建立及未知杂质β-同分异构体的研究分析，采用新型碱性色谱系统对β-异构体进行定性分析，但该方法并未充分评估β-异构体的检测灵敏度和盐酸普萘洛尔样品中β-异构体含量，且使用特殊新型耐碱色谱柱进行梯度洗脱，分析时间长，分析成本高。本研究以盐酸普萘洛尔原料药为研究对象，参考相关文献[10-14]和合成工艺[15-17]，对盐酸普萘洛尔原料药中的β-普萘洛尔杂质开展研究，建立了一种快速简便、灵敏的分析方法，可为盐酸普萘洛尔原料药的质量控制提供有效参考。

1、仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪(LC-2030C 3D日本SHIMADZU公司)；电子天平(QUINTIX35-1CN型，感量：0.01 mg，德国Sartorius公司)；威立雅purelab flexⅡ纯水机(法国Veolia公司)；Five Easy plus 20 pH计(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2试药

β-普萘洛尔对照品(麦克林，批号：I972069，CAS号2007-72-9，纯度：95.1%)，盐酸普萘洛尔对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100793-201202，含量：100.0%)，盐酸普萘洛尔原料药1(批号：170301，企业1生产)，盐酸普萘洛尔原料药2(批号：231201，企业2生产)。

十二烷基硫酸钠(优级纯，阿拉丁试剂)；磷酸二氢四丁基铵(优级纯，麦克林试剂)；氢氧化钠(分析纯，南化试剂)；硫酸(分析纯，国药化学试剂)；乙腈(色谱纯，SKY Soltech)；实验用水(≥18.2 MΩ·cm，自制)。

2、方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为YMC-Pack ODS-AQ(150 mm×4.6 mm，3 µm)；流动相：取十二烷基硫酸钠3.2 g和四丁基磷酸二氢铵0.31 g，加水溶解并稀释至1000 mL，加入2 mL硫酸，搅拌均匀后，用2 mol·L-1氢氧化钠调节pH至3.3)-乙腈(70∶30)为流动相A，十二烷基硫酸钠和四丁基磷酸二氢铵溶液-乙腈(30∶70)为流动相B，在线等度洗脱A-B(70∶30)，柱温40℃；流速0.8 mL·min-1；检测波长225 nm；进样量20 µL。

2.2溶液的配制

2.2.1空白溶剂

流动相A与B(70∶30)作为空白溶剂。

2.2.2对照品溶液

取β-普萘洛尔对照品适量，精密称定，置100 mL量瓶中，用乙腈超声溶解并稀释至刻度，得质量浓度为100 µg·mL-1的溶液，作为β-普萘洛尔对照品储备液①。精密量取上述对照品储备液①2 mL，置20 mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为10μg·mL-1的溶液，作为对照品储备液②。精密量取上述对照品储备液①1 mL，置100 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，制成质量浓度为1 µg·mL-1的对照品溶液。

2.2.3定量限溶液

精密量取“2.2.2”项下对照品储备液②0.3 mL，置200 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，制成β-普萘洛尔质量浓度为0.015 µg·mL-1的溶液。

2.2.4系统适用性溶液

取盐酸普萘洛尔对照品适量，精密称定，置100 mL量瓶中，再精密加入“2.2.2”项下对照品储备液①1 mL，用溶剂溶解稀释至刻度，摇匀，配制成含普萘洛尔质量浓度为100 µg·mL-1、含β-普萘洛尔质量浓度为1 µg·mL-1的溶液。

2.2.5供试品溶液

取盐酸普萘洛尔原料药样品适量，精密称定，置100 mL量瓶中，用溶剂溶解稀释至刻度，配制成含普萘洛尔质量浓度为100 µg·mL-1的溶液。

2.2.6酸破坏溶液

取盐酸普萘洛尔原料药2(批号：231201)11.3 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加入1 mol·mL-1盐酸溶液1 mL，置于100℃条件下加热破坏1 h，加入等量碱中和后，用溶剂稀释定容至刻度，作为原料酸破坏溶液。同法制备试剂空白。

2.2.7碱破坏溶液

取盐酸普萘洛尔原料药2(批号：231201)11.3 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加入1 mol·mL-1氢氧化钠溶液1 mL，置于100℃条件下加热破坏1 h，加入等量酸中和后，用溶剂稀释定容至刻度，作为原料碱破坏溶液。同法制备试剂空白。

2.2.8氧化破坏溶液

取盐酸普萘洛尔原料药2(批号：231201)11.3 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加入30%过氧化氢溶液1 mL，置于100℃条件下加热破坏0.5 h，用溶剂稀释定容至刻度，作为原料氧化破坏溶液。同法制备试剂空白。

2.2.9强光破坏溶液

取盐酸普萘洛尔原料药2(批号：231201)11.3 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加入1 mL水溶解后，置于4500 lx光照条件下放置24 h，用溶剂稀释定容至刻度，作为原料强光破坏溶液。同法制备试剂空白。

2.3波长选择

通过二极管阵列检测器对普萘洛尔和β-普萘洛尔进行考察，发现β-普萘洛尔的最大吸收波长为225 nm(见图2)，在290 nm处几乎无吸收，而普萘洛尔在290 nm和214 nm有最大吸收。采用225 nm作为β-普萘洛尔的检测波长。

2.4系统适用性试验

精密量取“2.2.4”项下系统适用性溶液(含1%β-普萘洛尔)20 µL，进样分析。在系统适用性试验中，β-普萘洛尔理论塔板数为19 051，拖尾因子0.998，β-普萘洛尔与普萘洛尔峰分离度为2.367，均符合要求(见图3)。

2.5专属性试验

图2β-普萘洛尔与盐酸普萘洛尔的UV光谱图

1.β-普萘洛尔(β-propranolol)；2.普萘洛尔(propranolol)

图3系统适用性色谱图

1.β-普萘洛尔(β-propranolol)；2.普萘洛尔(propranolol)

精密量取空白溶剂、对照品溶液、定量限溶液、供试品溶液(170301批、231201批)、酸破坏溶液、碱破坏溶液、氧化破坏溶液以及强光破坏溶液各20 µL，进样分析，记录色谱图，结果见图4。空白溶剂对β-普萘洛尔测定无干扰；β-普萘洛尔的保留时间为15.84 min，普萘洛尔的保留时间为16.96 min，两者的分离度为2.37；原料强制破坏性试验表明，盐酸普萘洛尔经过酸、碱、氧化、强光强制破坏后，产生的降解杂质对β-普萘洛尔的测定无干扰。

2.6定量限和检测限

分别精密量取“2.2.2”项下对照品储备液②0.3 mL、0.1 mL，置200 mL量瓶中，用溶剂分别稀释制成β-普萘洛尔质量浓度约为0.015 µg·mL-1、0.005 µg·mL-1的溶液，作为定量限和检测限溶液，进样分析，记录色谱图，结果计算得检测限为0.1 ng，定量限为0.3 ng。

2.7线性关系考察

分别精密量取“2.2.2”项下对照品储备液②0.15、0.5、1、2、5、10、20 mL，置100 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，配制得到质量浓度分别为0.015、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μg·mL-1的溶液，依法测定，以β-普萘洛尔质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=3.579×105X-916.3，r=0.9999(n=7)。结果表明，β-普萘洛尔在0.015～1.981μg·mL-1与峰面积线性关系良好。

2.8加样回收试验

取盐酸普萘洛尔原料2(批号：231201)11.3 mg，精密称定，分别置100 mL量瓶中，再分别向其中加入“2.2.2”项下对照品储备液①0.1、1、2 mL，用溶剂溶解稀释定容至刻度，摇匀，制成含β-普萘洛尔为0.1μg·mL-1(0.1%)、1μg·mL-1(1%)及2μg·mL-1(2%)3个浓度水平，每个浓度水平配制3份，进样测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算回收率。结果β-普萘洛尔低、中、高浓度的平均回收率分别为99.06%、100.4%、100.5%(n=3)，RSD分别为0.18%、0.10%、0.060%。

2.9精密度试验

取盐酸普萘洛尔原料1(批号：170301)，按“2.2”项下方法配制6份供试品溶液，进样测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算含量。结果β-普萘洛尔含量均值为0.542%，RSD=0.76%(n=6)，表明本方法精密度良好。

2.10溶液稳定性试验

图4专属性试验色谱图

取同一β-普萘洛尔对照品溶液和盐酸普萘洛尔原料1(批号：170301)供试品溶液，分别于室温下放置0、2、8、15、20 h，依法进样，记录色谱图，对照品溶液和供试品溶液峰面积RSD分别为0.43%、0.33%(n=5)，表明供试品溶液在20 h内稳定。

2.11耐用性试验

通过改变检测波长(±2 nm)、柱温(±2℃)、流速(±0.1 mL·min-1)、流动相的有机相比例(±2)、pH值(±0.2)，考察检测参数微小变动对系统适用性试验溶液和β-普萘洛尔测定结果的影响，结果表明试验条件微调，β-普萘洛尔和主峰的分离度均符合要求，普萘洛尔不干扰β-普萘洛尔的检测，耐用性良好。

2.12样品含量测定

取两批盐酸普萘洛尔原料药，分别按“2.2.5”项下方法配制供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，按外标法计算。结果原料1(批号：170301)中β-普萘洛尔含量为0.542%，原料2(批号：231201)中未检出β-普萘洛尔。

3、讨论

同分异构体杂质β-普萘洛尔的理化性质与盐酸普萘洛尔相似，采用现行各国药典规定的常规C18柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)的色谱系统难以将其分离。笔者也曾采用Phenomenex Titank、Welch Ultimate、Kromasil 100-5-C18等色谱柱，均无法将β-普萘洛尔与普萘洛尔分离。最后选用对亲水化合物和强极性化合物有分离优势的YMC-pack ODS-AQ柱后，杂质的分离度得到了较大改善。流动相系统沿用药典标准规定的双离子对系统[13](十二烷基硫酸钠和磷酸二氢四丁基铵)，通过增加离子对试剂的浓度，增加待测成分的保留，又通过筛选合适的乙腈比例使β-普萘洛尔与普萘洛尔获得良好的峰形与分离度。

通过合成工艺分析，β-普萘洛尔主要来源于起始物料α-萘酚的副产物杂质β-萘酚[15-17]。本方法中测定了两个不同企业生产的盐酸普萘洛尔原料，其中原料药1(170301批)中检出β-普萘洛尔为0.542%，原料药2(231201批)中未检出β-普萘洛尔(低于0.005%)。回顾原料药1和原料药2的合成工艺大致相同，原料药1在起始物料阶段未充分控制α-萘酚中β-萘酚的含量，原料药2在起始物料阶段控制α-萘酚中β-萘酚的含量在0.016%～0.022%内，最终成品的β-普萘洛尔含量低于0.005%，说明通过严格控制起始物料α-萘酚的质量，可以有效控制盐酸普萘洛尔原料中β-普萘洛尔的含量。

本文建立了快速测定盐酸普萘洛尔原料药中β-普萘洛尔含量的液相色谱法，该方法专属性强、灵敏度高，简单、快速、准确度高，可为盐酸普萘洛尔中同分异构体杂质β-普萘洛尔的质量控制提供参考。

参考文献:

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文章来源:崔萍,商少华,曹庆丰.高效液相色谱法测定盐酸普萘洛尔中同分异构体杂质β-普萘洛尔的含量[J].中南药学,2024,22(09):2415-2419.